pGBKT7-53 Vector 酵母双杂交对照载体的关健特征和实验步骤「实验室干货」

【🍬参数信息】

英文名称：pGBKT7-53 Vector 酵母双杂交对照载体

载体类型：酵母双杂交系统载体

克隆菌株：DH5α

载体标签：c-Myc

筛选标记：TRP1

启动子：ADH1

表达宿主：酵母细胞

5'测序引物：T7: TAATACGACTCACTATAGGG

3'测序引物：根据序列设计引物

纯度：≥95%

储存条件：-20℃避光干燥

生产厂商：西安强化生物科技

【简单概述】

pGBKT7-53 Vector 是酵母双杂交系统的阳性对照载。

其核心功能是表达 GAL4 DNA 结合域（DNA-BD）与小鼠p53 蛋白片段的融合蛋白，用于验证酵母双杂交系统的可靠性。

关键特征

载体结构

融合蛋白组成：

GAL4 DNA-BD（氨基酸 1-147）：负责结合靶基因启动子。

小鼠 p53 蛋白（氨基酸 72-390）：已知与 SV40 大 T 抗原相互作用的肿瘤抑制蛋白。

启动子：ADH1 启动子驱动融合蛋白的高水平表达。

标签：c-Myc 表位标签，便于抗体检测。

克隆位点：p53 cDNA 插入 EcoRI 和 BamHI 位点之间。

载体参数

大小：8.3 kb或 8275 bp。

抗性基因：

原核抗性：卡那霉素（Kanamycin）。

真核筛选标记：TRP1（酵母色氨酸合成基因）。

复制子：

pUC ori（大肠杆菌复制起点）。

2μ ori（酵母复制起点）。

来源

p53 cDNA 源自 Lwabuchi 等（1993）描述的质粒，经 Clontech 改造。。

【使用方法】

一、载体特性与用途

载体本质：

编码 GAL4 DNA结合域（BD, 1-147aa） 与 小鼠p53蛋白（72-390aa） 的融合蛋白，用于模拟已知蛋白质相互作用（如p53与SV40大T抗原）。

作为阳性对照，验证酵母双杂交系统的可靠性（例如：当与pGADT7-T共转化时，应激活报告基因）。

二、实验步骤

（一）载体准备

质粒溶解：

收到冻干粉后，5000 rpm离心1分钟，加入20 μl无菌水重悬，室温放置1分钟。

测定浓度（建议≥100 ng/μl），保存于-20℃。

质粒转化（大肠杆菌）：

将质粒转化至 DH5α 等感受态细胞，37℃培养，卡那霉素（50 μg/ml）筛选。

挑取单菌落扩增，提取高纯度质粒备用（避免直接使用冻干粉）。

（二）酵母转化与对照实验

酵母感受态制备：

使用 Y2HGold 或 AH109 等标准酵母菌株，制备感受态细胞（如LiAc/PEG法）。

共转化（阳性对照设置）：

实验组：pGBKT7-53（诱饵） + pGADT7-T（猎物，编码SV40 T抗原）。

阴性对照：

pGBKT7-53 + 空pGADT7载体

pGBKT7-Lam（编码Lamin C，无互作） + pGADT7-T。

转化操作：

将质粒（0.1–1 μg）与感受态酵母混合，热激（42℃, 15分钟），涂布于 SD/-Trp 平板（筛选pGBKT7-53转化子）。

30℃培养3–5天，挑取直径≥2 mm的单菌落。

（三）自激活与毒性检测（关键质控）

自激活测试：

将含pGBKT7-53的酵母菌落接种至：

SD/-Trp（基础筛选）

SD/-Trp/-His/X-α-Gal（或 QDO/X/A 培养基）。

若在缺陷培养基上生长并显蓝色（报告基因激活），说明p53融合蛋白可能自激活，需调整3AT浓度抑制。

毒性检测：

比较转化子与空载体对照的生长速度，若生长延迟则提示蛋白毒性。

（四）互作筛选（以筛库为例）

交配法（Mating）：

将含pGBKT7-53的 Y2HGold 菌株与含文库（pGADT7-XXX）的 Y187 菌株混合，30℃培养24–48小时。

涂布于 DDO（SD/-Leu/-Trp） 和 QDO（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal） 平板，筛选阳性克隆（QDO上生长且显蓝）。

阳性克隆验证：

菌落PCR：使用载体特异性引物（如T7启动子引物）扩增插入片段。

测序鉴定：排除重复克隆，比对序列确认互作蛋白。

点对点验证：将候选猎物质粒与pGBKT7-53再次共转化，重复互作实验。

【相关试剂】

FITC-Con A FITC

Cy7 tetrazine Cy7四嗪

Cy7 tetrazine Cy7四嗪

Cy5.5 tetrazine Cy5.5四嗪

Texas Red TCO 单一异构体

Cy3B azide Cy3B 叠氮化物

CDCF 活性氧ROS荧光探针

BL21 Chemically Competent Cell

BL21 Star (DE3) pLysS Competent Cell

JM109(DE3) Chemically Competent Cell

HT115(DE3) Chemically Competent Cell

ArcticExpress(DE3)Chemically Competent Cell

EPI400 Electrocompetent cell 大肠杆菌电转感受态细胞

ER-TrackerTM Blue-White DPX, for live-cell imaging

OverExpress C43(DE3)pLysS Chemically Competent Cell

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本试剂仅适用于科研实验，敬请知悉。

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