pGBKT7-Lam Vector 酵母双杂交对照载体的实验步骤「小白也能上手！」

标题：pGBKT7-Lam Vector 酵母双杂交对照载体

【🍬参数信息】

英文名称：pGBKT7-Lam Vector 酵母双杂交对照载体

中文名称：pGBKT7-Lam Vector 酵母双杂交对照载体

载体类型：酵母双杂交系统载体

载体大小：7.9kb

原核抗性：卡那霉素（Kanamycin, Kan）

克隆菌株：DH5α

载体标签：c-Myc

筛选标记：TRP1

启动子：ADH1

表达宿主： 酵母细胞

5'测序引物：T7: TAATACGACTCACTATAGGG

3'测序引物：根据序列设计引物

纯度：≥95%

储存条件：-20℃避光干燥

生产厂商：西安强化生物科技

【简单概述】

pGBKT7-Lam是一种用于酵母双杂交系统的阴性对照载体，由基础载体pGBKT7改造而来。

其核心特征包括：

结构组成：

表达人核纤层蛋白C（Lamin C）与GAL4 DNA结合域（DNA-BD）的融合蛋白，其中Lamin C包含66–230位氨基酸片段，DNA-BD包含1–147位氨基酸片段。

含c-Myc表位标签，便于融合蛋白的免疫检测。

启动子系统：ADH1启动子驱动融合蛋白在酵母细胞内表达；T7启动子支持体外转录翻译。

抗性标记：原核宿主（如大肠杆菌）使用卡那霉素抗性（KanR），真核宿主（酵母）使用TRP1营养筛选标记。

复制原点：2μ ori（酵母）和pUC ori（大肠杆菌），支持双宿主复制。

载体大小：7.9 kb（含插入片段）。

设计目的：

作为酵母双杂交实验的标准化阴性对照，用于检测假阳性相互作用背景。

【实验步骤】

（一）载体转化与质粒扩增（大肠杆菌）

感受态准备：使用DH5α等克隆菌株，冰上解冻感受态细胞。

转化：

取2μl质粒加入100μl感受态细胞，冰浴30分钟。

42℃热激90秒，冰浴2分钟。

加入900μl无抗LB培养基，37℃震荡培养45分钟。

离心（6000 rpm, 5分钟）后重悬菌体，涂布于含卡那霉素（50μg/ml）的LB平板。

验证：挑取单克隆扩增后，通过酶切（如BamHI/PstI）或测序（引物T7 Forward）确认载体正确性。

（二）酵母转化（酵母双杂交系统）

酵母菌株：常用Y2HGold、AH109等。

共转化要求：

阴性对照设置：需与pGADT7-T（或空pGADT7）共转化，形成完整对照系统。

阳性对照：pGBKT7-53 + pGADT7-T（验证系统有效性）。

转化步骤：

制备酵母感受态细胞（如LiAc/PEG法）。

加入pGBKT7-Lam及配对载体（如pGADT7-T），冰浴30分钟。

42℃热激15分钟，涂布于SD/-Trp/-Leu（DDO）平板筛选共转化子。

（三）阴性对照验证实验

培养基筛选：

将共转化酵母接种至四缺培养基（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp，即QDO），添加X-α-gal（显色剂）和3-AT（抑制弱自激活）。

预期结果：

无生长（或微弱生长）：表明无假阳性相互作用。

无蓝色显色：排除报告基因（如MEL1）激活。

自激活检测：若pGBKT7-Lam单独转化酵母后在QDO/X平板上生长，需优化3-AT浓度抑制自激活。

（四）结果分析与注意事项

假阳性排查：若阴性对照在QDO/X/A培养基生长，需检查载体构建是否污染或实验操作误差。

毒性检测：观察酵母菌落大小，若显著小于阳性对照，提示融合蛋白可能有毒性。

保存：转化成功的酵母菌株可加甘油冻存于-80℃。

【相关试剂】

DAF-FM DA (5mM in DMSO)

Sodium Nitroprusside(SNP)

S-Nitrosoglutathione(GSNO)

K599 Chemically Competent Cell

K599 Electrocompetent Cell

Ar A4 Chemically Competent Cell

Ar A4 Electrocompetent Cell

Ar Qual Chemically Competent Cell

Ar Qual Electrocompetent Cell

Ar 1193 Chemically Competent Cell

ER-TrackerTM Blue-White DPX, for live-cell imaging

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本试剂仅适用于科研实验，敬请知悉。

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