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HEPG2细胞做侵袭实验细节
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我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞就要分泌金属蛋白酶将基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，我们检测高营养的培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了。而迁移实验就是不铺胶直接让细胞穿过就行了。
上层培养液采用低血清或无血清培养基，为维持渗透压。
下层常用含5%－10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子，比如纤维粘连蛋白。
聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司、sigma叫ECM。是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。
将冻存于－80度冰箱的BD matrigel 4度过夜（24h），变成液态；
上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为， 放入37℃培养箱中，孵育1-5h（<5h）；此间经常观察，当出现“白色层”时，说明已经变为固态;(注意：铺胶过程不要产生气泡，铺胶均匀，否则影响实验结果。）
无血清培养基洗3次，计数调整细胞密度至1－10×105，（注意：具体密度根据孔板大小和侵袭能力来决定）
容易堆积聚团成岛屿状增值，在铺板时候一定要消化分散成单个细胞。
用无血清培养基洗 Matrigel洗1次；每孔加入100ul细胞悬液；
下腔室中加入10-20％FBS条件培养基；（注意下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失。在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。）
37℃培养箱中，孵育12-48h；（注意：根据细胞的增值速度和药物抑制率）；
取出transwell用PBS洗2遍，用无钙PBS洗2遍，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，甲醇或者甲醛固定30分钟，将小室适当风干，用 0.1% 结晶紫染色30-60 min，用PBS洗3遍。用棉签轻轻擦掉上室水分。
400倍显微镜下随机记录五个视野观察细胞，记数
（1）由于药物对细胞有毒性和细胞的敏感性不同，需要确定的处理浓度和作用时间。更好的方法是,用细胞生长曲线来确定细胞在不同药物浓度下的生长状态，选择合适的细胞处理浓度和时间。
（2）用药物处理细胞时，需要先知道药物的 IC50，药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50这是药物对细胞增殖的抑制浓度。处理细胞时，应该使用浓度低于 IC50 的药物，以细胞在实验时间内仍能增殖。
（3）先将细胞消化后，使用不同浓度药物、低血清或无血清培养基一起重悬细胞，然后加入到小室中12-48h观察侵袭能力。建议做复孔。
原创作者：上海中乔新舟生物科技有限公司
