产品简介
Y2HGold 菌株是 Clontech 公司开发的 GAL4 系统酵母双杂实验用菌株，MATa 型，可直接转化质粒或与 MATα 型酵母菌株 Y187 通过 mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker为：trp1，leu2，报告基因为： AbAr，HIS3，ADE2，MEL1。Y2HGold-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGBKT7 和 pGADT7。质粒 pGBKT7 的筛选标志为 TRP1，用于表达 DNA-BD (来
自酵母转录因子 GAL4N 端 1 ~ 174 位氨基酸)与目标蛋白 (Bait) 的融合蛋白；质粒 pGADT7 的筛选标志为 LEU，用于表达 AD(GAL4 C 端 768 ~ 881 位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4 系统原理：一个完整的酵母转录因子 GAL4 可分为功能上相互独立的两个结构域：位于 N 端 1 ~ 174位氨基酸区段的 DNA 结合域 (DNA-BD)和位于 C 端 768 ~ 881 位氨基酸区段的转录激活域 (AD)。DNA-BD 能够识别 GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS，并与之结合。而 AD 可以启动 UAS下游的基因进行转录。BD 和 AD 单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的 GAL4活性，使含有 UAS 的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD 不与 AD 结合，将要检测的蛋白质分别与 BD 和 AD 融合，形成 bait 融合蛋白 (bait -BD)和 prey 融合 蛋白 (prey-AD)，如果 bait 和prey 发生相互作用，就会促使 BD 和 AD 的相互接近，形成完整的 GAL4，从而激活报告基因的转录。Y2HGold 有四个报告基因：AbAr，HIS3，ADE2，MEL1，分别由三种不同的启动子 (G1，G2，M1) 启动，这三种启动子只有 GAL4 识别的 17 bp 核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。此外新报告基因 AbAr 与以的营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，也可以降低酵母双杂假阳性发生的概率。2HGold 感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7 质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA。
产品组分
Y2HGold Competent Cell
100 μl /支
-80℃（3 个月）
基因型：MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-Gal1TATA-His3,
GAL2UAS- Gal2TATA-Ade2 URA3::MEL1UAS-Mel1TATA AUR1-C MEL1
使用方法：
1. 从-80℃取出 Y2HGold 感受态细胞，置于冰上融化，依次加入预冷的目的质粒 2-5 µg，Carrier DNA (95-100℃，5 min，快 速冰浴，重复一次) 10 µl，PEG/LiAc 500 µl ，吸打混匀，30℃水浴 30min (15 min 时翻转 6 - 8 次混匀)。
2. 42℃水浴 15 min (7.5 min 时翻转 6 - 8 次混匀)。
3. 5000 rpm 离心 40 s 弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30 s 弃上清。
4. ddH2O 50 µl 重悬，涂板，29℃培养 48 - 96 h。
● 培养基配制
① YPDA (1L): Tryptone 20 g ，Yeast extract 10 g ，0.2% adenine 15 ml 补水到 950 ml，用盐酸调 pH
到 6.5； Agar 20 g(for plates only) 121℃，15 min 高压灭菌； 待培养基温度降到 55℃时，加入已过
滤的 40% 葡萄糖 50 ml。
② SD medium (1L): Yeast Nitrogen base 6.7 g ，葡萄糖 20 g ，Dropout 适量（按说明书） 补水到 1L，
调 pH 至 5.8； Agar 20 g(for plates only) 121℃，15 min 高压灭菌。
③ 0.2% adenine (1L): Adenine 2 g,，补水到 1 L；溶解后高压灭菌或 0.22 µm 滤膜过滤除菌。
注意事项
1. 感受态细胞好在冰上融化。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。
3. 同时转化 2 - 3 种质粒时可增加质粒的用量。
4. Y2HGold 酵母菌株对高温敏感，适生长温度为 27 - 30℃；高于 31℃，生长速度和转化效率呈
指数下降。
5. 菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine 以供利用，然而，有些菌株的ADE2 基因被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6. 酵母在缺陷培养基中生长速度比 YPDA 培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂 YPDA 平板 29℃，48 h 培养可见直径 1 mm 克隆；涂 SD 单缺平板 29℃，48 - 60 h 培养可见直径 1 mm 克隆，涂 SD 双缺平 板 29℃，60 - 80 h 培养可见直径 1 mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板平板 29℃，80 - 90h 培养可见直径 1 mm 克隆。
