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转基因植物PAT基因PCR检测试剂盒2022动态已更新

点击次数：862 发布时间：2022/8/24 14:52:02

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胡**

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PCR试剂盒是基于 T7 RNA 聚合酶的 RNA 体外转录试剂盒，它利用含有 T7 启动子的模版 DNA，以 NTP 为底物，从 T7 启动子下游开始合成与模版 DNA 中一条链互补的 RNA，简单快速获得大量的 RNA 分子。

本产品具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需提供含T7 启动子的DNA 模板即可以进行体外转录实验，不需要单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模版 DNA 可以是线性化的质粒 DNA，也可以是 PCR 扩增产物。
4. 可以合成的 RNA 的*佳长度在 20nt 到 2000 nt 之间。
5. 产品配方经过精心优化，每 ug DNA 模版可以合成 2-6 ug RNA。
6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX 技术和 RNA 干扰（RNAi）等实验。
7. 本试剂盒足够 50 次 20uL 体系的体外转录实验。规格及成分成份编号十孔盒包装 T7 转录预配液（2×） 91106a 0.5 mL 阳性对照 DNA（1.3 Kb 片段） 91106b 20 uL （10 ng/uL） T7 RNA 聚合酶 91106c 50 uL RNase-free 水 80403 1 mL 使用手册 91106sc 1 份运输及保存低温运输，-20℃保存、有效期一年。自备试剂 Tris 饱和酚、RNase-free 75%乙醇(均可从本公司另购) 相关资料一、制备 DNA 模板（本试剂盒不含所需试剂，此处信息仅供参考） PCR 片段和质粒 DNA 都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的 DNA。如果是质粒 DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的DNA 序列的上游必须有T7 启动子。如果模板是PCR 产物，则可以在设计引物时将 T7 启动子序列（5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’）加上。如果是将 DNA 片段克隆到载体上，则需要选择有 T7 启动子的载体，并且克隆位点必须位于 T7 启动子下游。三是需要转录的 DNA 序列的下游端不要是 3’突出。如果是 3’突出（比如选择了 Pst I 来线性化质粒），则用 T4 DNA 聚合酶修平。四是必须 DNA 模板中没有 RNase。由于提取质粒 DNA 的过程中一般要使用大量的 RNase A，因此质粒 DNA 一般都有严重的 RNase A 污染，总 RNA 一起保温，然后电泳检测 RNA 是否被降解，以此来判断纯化的 DNA 模板是否有残留 RNase A。如果有 RNase 污染，则必须反复酚-抽提去除残留的 RNase，然后再乙醇沉淀质粒 DNA。
二、体外转录反应

1. 在两个 RNase-free 的塑料离心管中，在室温下（不是在 4℃下）分别按次序加入下列成分（T7 转录预配液容易产生结晶沉淀，一定要握在手中直到结晶溶解并摇匀后方可使用）：注：此为 20uL 反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比例增减。本产品的 T7 转录预配液已经含有NTP。如果需要标记 RNA 探针，则需要订购 NTP 分开的试剂盒。如果需要得到加帽 RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸（NEB 公司有此产品）。
2. 37℃保温 1-2 小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热 10 分钟灭活 T7 RNA 聚合酶。
4. 取 1-3 uL 电泳检测转录效果。一般 1 ug DNA 可以合成 5-10 ug 的 RNA。
5. 得到的 RNA 可以放-80℃保存。如需去除 DNA 模板，请按下面步骤操作。
三、去除 DNA 模板（所需试剂需要另购）
1. 在体外转录体系中加入 1 uL 自备的 RNase-free DNase （3-5 U/uL）。成分样品管对照管 DNA 模板 PCR 片段质粒 DNA 50 ng 左右 1 ug 左右不加阳性对照片段不加 4 uL T7 转录预配液，2× 10 uL 10 uL T7 RNA 聚合酶 1 uL 1 uL RNase-free 水补水到 20uL 补水到 20uL
2. 37℃保温 15-30 分钟。
3. 补水到 100 uL。
4. 用自备的等体积（100 uL）的 Tris 饱和酚-抽提一次去除残留的 DNase 和 RNA 聚合酶。
5. 加自备的 200 uL 无水乙醇，振荡后 15000 rpm 离心 20-30 分钟，弃上清（含 NTP 和盐离子等成分）。
6. 加入 1mL 75%乙醇，震荡 10后15000rpm 离心3-5 分钟，弃上清。
7. 短暂离心数，用枪头吸弃上清。
8. 晾干，所得沉淀即体外转录所得的 RNA。可溶于 RNase-free 水中后立即使用或放-80℃保存。
疑难解答
1、没有 RNA 产物。*常见原因是模板有 RNase 污染，可用纯化的 RNA 跟模板DNA 一起保温，再检测 RNA 是否降解。还可以增加 RNase Inhibitor 用量，本试剂盒缓冲液和酶混合液中有 RNase inhibitor，如果模板 RNase 污染严重，可能需要用户补加 RNase inhibitor。
2、RNA 产量低。*常见的原因是 DNA 模板。在转录序列的一个和第二个碱基都是 G，在 14 个碱基内避免有 U 存在。 3、RNA 长度比预期的短。可能是模板序列中有 T7 RNA 聚合酶的终止序列。可以改用 SP6 体外转录试剂盒（启动子也必须改成 SP6 启动子）。

4、RNA 长度比预计的长。T7 RNA 聚合酶跟 Taq DNA 聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，*多有一半的 RNA 可以带一个或两个碱基的尾巴。如果 RNA 长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒 DNA，则可能是质粒 DNA 线性化不。 5、5’单磷酸还是三磷酸。如果使用 GTP，则得到的 RNA 是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如 12 小时），则有 50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入 GMP，则 T7 RNA 聚合酶将优先使用 GMP，所得 RNA 产物中 5’端是单磷酸的比例将大大增加。
6、用体外转录试剂盒如何得到带帽 RNA？
7、需加入带帽 NTP 类似物即可。

原创作者：北京伊莱瑞生物科技有限公司

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