人口腔角质细胞的的培养信息及应用

　　人口腔角质细胞

　　不同分化阶段的角质细胞构成了皮肤的表皮层的五层结构，由外至内分别为角质层、透明层、颗粒层、棘层和基底层。角质细胞构成的表皮层起到了屏障功能。

　　口腔黏膜角化细胞是口腔疾病主要屏障，保护局部细胞免受微生物和化学物质造成的伤害。它们通过不断产生或受刺激后产生的细胞因子，刺激参与促发炎症反应，这意味着它们可能通过炎症过程潜在地参与口腔感染的调控，该过程需要不同的白细胞介素参与，如IL-1和IL-18。口腔黏膜角化细胞表达多种不同的细胞标志物，该表达受到目标基因转录过程中钙素诱导变化的影响。

　　口腔黏膜角化细胞与特征明显的皮肤角质细胞在结构和功能上有很大的相似性，并且为研究角质细胞的生物学特性、无限增殖过程、恶性转化提供了良好的模型。

　　应用

　　用于槲皮素对人口腔角质细胞再生的生物学效应研究

　　用其脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）来模拟体外炎症环境,并且通过检测炎症因子IL-β1和TNF-α的基因表达来验证槲皮素的抗炎效果。

　　方法:（1）体外培养并传代扩增了原代HOKs,本实验用的细胞均于第4代与第五代之间。

　　（2）用CCK-8试剂盒分别检测含有20至200μM的槲皮素对人HOKs的毒性

　　（3）体外检测槲皮素对HOKs增殖能力的影响并与阳性对照表皮生长因子（EGF）做比较

　　（4）进行体外划痕伤创面愈合试验检测槲皮素对HOKs迁移能力的影响,分别在0h、12h、24h和48h时间点用光学显微镜观察单层细胞创面模型的愈合情况,并与阳性对照EGF做比较

　　（5）用Transwell迁移小室进一步验证槲皮素对HOK迁移能力的影响,24h后观测HOKs迁移情况,并与阳性对照EGF做比较

　　（6）ELISA法检测创面愈合过程中槲皮素对HOK细胞上清液中TGFβ-1和TGFβ-3的变化

　　（7）利用免疫荧光检测创面愈合初期,TGFβ-3在划痕边缘HOKs上的表达

　　（8）利用Pg.LPS建立体外炎症模型。将HOKs用槲皮素预处理3h后加入Pg.LPS,48h后,利用时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测TNF-α和IL-1β的表达水平,并与阴性对照组和炎症组比较。同时利用RT-qPCR检测在创伤条件下HOKs中生长因子（TGFβ-1,TGFβ-3）的基因表达水平。

　　结果:（1）用CCK-8试剂进行20-200μM不同浓度的槲皮素对HOKs细胞活性的检测。随着浓度的增加,槲皮素对HOKs的细胞活力有明显抑制作用。我们选出20μM的槲皮素来完成余下的实验。

　　（2）槲皮素对HOKs增殖的影响:实验数据显示,在24h时间点,槲皮素对细胞增殖无明显影响。在48h时间点,实验组比阴性对照组高6%,但仍无统计学意义。到了72h时,加入槲皮素的实验组比阴性对照组,增值率升高15%,有明显统计学差异（p<0.01）。

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