细胞培养实验的准备工作有哪些?---智立中特

一.细胞培养的基本原理

　　细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点在于原始培养的对象不同。细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块(0.5～1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米)，而器官培养使用的是器官原基或器官的一部分或整个器官。在组织培养中，细胞自组织块周围移出并生长，细胞在生长过程中总有移动(运动)或其它变动，这样就使被培养的组织难以维持其原有的结构和功能。培养时间越长，发生变化的可能性越大，结果常使单一类型的细胞保存下来，终成了细胞培养。在细胞培养中，细胞生命活动和体内细胞一样，仍然是相互依存的，呈现一定的组织特异性，所以组织培养和细胞培养实际上无严格区别。

二.细胞培养的基本设备与用品

　　(1)细胞培养的基本设备

　　细胞培养的基本设备有：CO2培养箱，倒置显微镜，净化台，压力蒸汽消毒器，自动双重纯水蒸馏器，液氮罐，冰箱，电热干燥箱，电热恒温培养箱，电动吸引器，抽气泵等。

　　(2)常用的实验用品

　　1.玻璃器皿

　　细胞培养所用的玻璃器皿应由透明度好、无毒的中性硬质玻璃制成。常用的有以下几种：国产螺旋口培养瓶[有12.5毫升，25毫升，100毫升等规格，国外培养瓶常以底面积(平方厘米)表示];培养皿(直径有3.5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等规格);离心管(5毫升，10毫升);注射器(1毫升，5毫升等);用生理盐水瓶代替的贮存瓶(100毫升，250毫升，500 毫升);青霉素瓶(5毫升);西力辛瓶(10毫升);其它还有尖吸管和移液管，载玻片(厚度0.8～1.2毫米)，盖玻片(厚度0.12毫米)，贮存尖吸筒用的玻璃筒或金属筒，漏斗，烧杯，量筒，贮蒸馏水瓶，冷冻管(1.5毫升，2毫升)等。

　　2.塑料品

　　多孔培养板规格有4、6、12、24、96孔等，培养皿直径有3厘米、6厘米、10厘米等。塑料品经消毒灭菌密封包装，供一次性使用，重复使用的需经特殊方法清洗消毒。塑料器材厚薄均匀，有的表面经特殊处理，细胞易于生长。

　　3.器械

　　解剖刀、眼科剪和镊(直头和弯头)、中号圆头镊、止血钳等。

　　4.杂用品

　　金属饭盒、试管架、各种规格胶塞、记号笔、搪瓷盘、吸头(吸取液体的胶帽)、酒精灯、酒精、碘酒棉球瓶、火柴等。

　　组织培养中使用多的是吸管、培养瓶、培养皿及各种瓶塞。实验者手中应有三套器材，瓶塞数要大于瓶数，才能实验中的循环使用。

三.细胞培养用品的清洗与消毒灭菌

　　(1)清 洗

　　1.常用玻璃器皿清洗

　　◇清洗要

　　浸泡

　　初次使用的玻璃器皿呈碱性，表面常附有灰尘和一些对细胞有毒的物质，如铝和砷等。空气湿度高时，玻璃器皿表面又易长霉。使用，新器皿浸泡在5%稀盐酸中过夜，以中和玻璃表面的碱性物质并去除霉斑;然后经简单刷洗，流水冲洗(逐片进行)，蒸馏水浸泡，干燥备用。新玻片处理后，短时间不用时，需将它投入95%的酒精中保存，以防玻片长霉。培养后的玻璃器皿应立即投入清水中浸泡，器皿中残留的细胞、蛋白质一旦干涸，即固着于玻璃表面，难脱落。

　　刷洗

　　用过的玻璃器材经自来水冲洗后，浸入水中煮沸，然后将适量洗涤剂(洗洁精或洗衣粉)投入沸水中继续煮沸10分钟，趁热刷洗器皿内外，刷洗后浸入清水中进行冲洗。

　　酸泡

　　刷洗好的玻璃器材干燥后置清洁液中浸泡24小时，清洁液的强氧化作用可清除刷洗不掉的微量杂质。

　　◇清洗步骤

　　玻璃器材煮沸10分钟→刷洗→流水振荡冲洗15-20遍→50℃烤干→清洁液浸泡24小时→流水振荡后冲洗15-20遍→漓水→蒸馏水浸泡2次(每次24小时)→50℃烤干，待包装。

　　◇清洗注意事项和要求

　　①使用后的实验器材应立即投入清水中。

　　②浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。

　　③刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗，不得残留洗涤剂、清洁液。方法是：每瓶灌2/3容积的自来水，振荡后倒掉，重复15—20次(尖滴管置量杯中冲洗)。

　　④煮沸的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂(直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右)。若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂，均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化，pH值上升。

　　⑤软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。玻璃划痕处易残留洗涤剂，会改变培养液pH值和毒害细胞。

　　⑥清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落入灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。

　　⑦使用后的胶塞与玻璃器材同时煮洗时，胶塞要放在煮锅的底部。

　　⑧浸泡器材的蒸馏水容器要用，并做好标记，如“蒸馏水Ⅰ盆”、“蒸馏水Ⅱ盆”。

　　⑨器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作，省时又清洗质量。

　　⑩用超声波仪清洗器材时，清洗要求同上。

　　2.橡胶制品的清洗

　　新购置的橡胶制品(胶塞、胶管、橡皮乳头)的洗涤方法如下：0.5摩尔/升NaOH煮沸15分钟→流水冲洗→0.5摩尔/升HCl煮沸15分钟→流水冲洗→自来水煮沸2次→蒸馏水煮沸20分钟→50℃烤干备用。这样处理可除净胶塞上的硫磺等有毒物质。用过的胶塞，其清洗方法、要求基本同玻璃器材。因胶塞使用面常沾有洗涤剂，流水冲不净，故胶塞洗刷的重点部位是胶塞使用面，用刷逐个刷洗。在使用过程中，胶塞不能与培养液接触，以防未洗净的胶塞污染培养液和细胞。

　　3.G6除菌滤器的清洗

　　新G6除菌滤器置玻璃洗液中浸泡24小时，流水缓慢冲洗，至pH值为5.5左右，然后用4倍的蒸馏水缓慢冲洗，再用重蒸馏水缓慢冲洗，烤干，包装消毒备用。用过的G6除菌漏斗立即浸泡水中(注意：滤器千万不能干涸)过夜，流水缓慢冲洗24小时或更长时间，至滤面基本疏通时，50℃烤干，滤器再置清洁液中浸泡24小时，或装满清洁液自然过滤。流水冲洗及其后的处理同新G6除菌滤器。

　　4.正压除菌滤器的清洗

　　新的或使用后的正压滤器经稀洗涤剂刷洗水冲洗15分钟→漓水→去离子水浸泡24小时→三蒸水浸泡24小时→干燥备用。

　　5.塑料制品的清洗

　　塑料制品质地软且耐腐蚀能力强，但不耐热，易出现划痕。其清洗程序为：器皿用后立即用流水冲洗→浸于自来水中过夜→用纱布、棉签和50℃稀洗液刷洗→流水冲洗(人工冲洗15—20遍)→晾干→浸于清洁液中15分钟→流水冲洗→蒸馏水浸泡两次(每次24小时)→晾干备用。

　　6.清洗液的配制

　　清洁液

　　新配制的清洁液为棕红色，遇有机溶剂或水分增多时变成绿色，表明失效。

　　先在搪瓷盆中加入蒸馏水，加热溶解重铬酸钾，再将盆置流 动自来水中，待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。

　　玻璃滤器洗液

　　取10克硝酸钠和28.6毫升浓硫酸，放入盛有470毫升蒸馏水的玻璃缸内混匀备用。

原创作者：智立中特（武汉）生物科技有限公司