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细胞的冻结与超低温冻存
点击次数：124 发布时间：2023/10/9 14:30:21
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肖**
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超低温保存生物样品的主要对象是细胞材料，即使是高等生物的组织/器官/胚胎的保存，评估指标也是以细胞学为基础的。
因此，生物材料的冻存，先是细胞冻结问题，一切影响细胞冻结的因素，都是冻存时必须考虑的。或者说，凡是对细胞冻结不利的技术都应避免使用。所谓细胞的冻结，实际上是细胞内外水的冻结，水冻结中中的变化过程/冻结状态对细胞生活力影响大。
水的冻结：生活细胞中含有大量的水分,约占细胞总重的60%~90%。与环境中的水存在形式不同,细胞中的水有游离水和结合水之分。其中游离水约占90%，比较容易冻结,一般在温度降至-25℃左右时,游离水就完,全冻结了。结合水存在于生物大分子之间，细胞处于-100℃超低温下，结合水仍处于非冻结状态。由于细胞内水的存在形式、冻结状态直接影响生物材料的冻存效果，所以细胞内水的存在形式、冻结状态是低温生物学中研究的重点。
在低温生物学基础研究中,还习惯按细胞内水的运动状态来讨论水的结构与性质,即将细胞内的水按结构分三层,或叫三种运动状态。细胞内与蛋白质、核酸、脂质等大分子和细胞器直接结合的水,称为A层水分子。A层水分子规则排列,热运动受到束缚,甚至在-100℃也不冻结。原生质中的大部分水为B层水分子,其分子排列随A层的变化而改变,当A层水分子排列紊乱,B层水分子反应敏感,并相应变乱。B层水分子的冻结温度约为-25℃。C层水分子是细胞膜表面的自由水,无论从排列到结构上都变化很大,且受环境因素的影响。通常细胞内含水量越低，C层水分子的结构化程度越高。另外,C层水分子的冻结温度较高,一般接近环境中水的冻结温度。
纯水的冻结温度在0℃左右,细胞内游离水在-25℃左右冻结。由于水的性质不同，不但冻结温度差异很大，而且冻结的状态也显然不同。纯水冻结形成同质冰核(冰晶);而细胞内的水以水溶液的状态存在,含有多种溶质(异物),冻结形成的冰核为同质和异质两类。两类冰核的多少与很多因素有关,其中水里存在不溶性异物的量是影响异质冰核形成的因素。此外,就水的冻结而论。水的不溶性异物越多,水的体积越大，冻结温度越低。
水溶液的冻结：溶液中由于溶质的存在而改变了水的物理性质,使其需要冷却到水的冰点以下才开始冻结。溶液的冻结过程,一般从过冷开始,随着冷却溶液中冰晶的生成,潜热不断产生,使温度骤然上升水不断结冰,不断释放潜热,直至达到共晶点,即饱和溶液的凝固点。溶液冻结形成冰晶的状态与溶质含量和降温速度呈正相关，增加溶质浓度,加快降温速度,可以获得玻璃化冰晶。实验证明50%的明胶或70%以上的甘油溶液进行快速冻结时，能形成玻璃化冻结状态。目，玻璃化冻结技术已用于动、植物细胞、组织、器官、胚胎等的冻存,具有广阔的应用景。
生活细胞的冻结：细胞内冻结和溶液的情况一样，通常在0℃以下过冷共晶点。但细胞冻结不仅,限于细胞内冻结,胞内冻结之先是胞外冻结。二者的冻结由冻结条件,特别是冷却速度决定。
(1)细胞外冻结冻存生活细胞均以液体悬浮状态开始，悬浮细胞的液体多为含低温保护剂(甘油,DMSO)的冻存液。尽管冻存液的溶质成分或浓度可因待冻存细胞(动物细胞、植物细胞微生物细胞)的不同而有所差别，但可以肯定，无论那种冻存液，它们含活化冰晶的异物远比细胞内要多，所以，悬浮细胞的冻结先是细胞外冻结(冻存液冻结)。此外，细胞内原生质的化学组成和物理性质的特殊性导致存在于狭小空间的水结冰较为困难也是细胞外先冻结的原因之一。
细胞外冻结受两种降温速率的影响:一种是同速降温,即细胞表面的冷却速度很小,胞外结冰缓慢,从而连续有热发生,使胞内的水分以很大速度流向胞外，减缓了胞外冻结速度。同速降温过程中,冰的生成与热的发生同冷却速度同步进行。另一种是慢速降温冷却，冷却速度明显慢于冰的生成和热的发生,增加了细胞内的水向胞外溢出的速度，使细胞在短期内不易结冰而脱水，适度的细胞内脱水对冻存是有益的。根据细胞外结冰与降温速率之间的关系，冻存生物细胞的二步冻结法，即先对细胞慢速降温(1.0℃/min)到-30℃,造成细胞外冻结，细胞内脱水，然后提高降温速度(5~10℃/min)降到-100℃以下，将细胞快速移到超低温冰箱或超低温生物样本库中长,期保存。二步降温冷冻法已被众多学者所接受，广泛用于生物材料的长,期冻存。
(2)细胞内冻结细悬浮在常规浓度的低温保护剂中，采用二步降温冷冻法或慢速降温冷冻为宜。快速降温容易使细胞内过早结冰或冻结，一旦细胞内过早冻结，对细胞有破坏作用，造成细胞结构的破坏,原生质浓缩,脱水呈网状。细胞融解后，可观察到细胞崩坏的残骸,胞内空泡增加。可见,细胞内的快速冻结对细胞长,期冻存是不利的。当然,玻璃化冻存技术例外,玻璃化冻存除提高保护剂浓度外，还需加快降温速度(1000~10000℃/min)，使细胞内水冻结冰晶体积非常小,出现玻璃状的冻结现象，这样才能使细胞免受伤害,达到细胞冻存的目的。
(3)细胞的超低温冻存。如所述，细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键。理论上讲,细胞外水的冻结温度为-5~-15℃,细胞内游离水在-25℃冻结，-30℃时,细胞几乎没有非冻结状态的自由水存在，而结合水在-100℃温度下也不冻结。根据Luyet的冻结理论，细胞游离水的冻结温度(-30℃)可被认为是细胞冻存的安全温度，因细胞的二步冻结法是以-30℃为基础的，在如此温度条件下，细胞可以达到冻存的目的。但事实上,细胞冻存的检测结果并非如此,即便是在零下-80℃冷库保存条件下,冻存细胞(尤其是动物细胞和植物细胞)也不能达到长,期保存的目的;只有在-135℃的超低温条件下，细胞的冻存才是安全、可靠的。由此看来,细胞的超低温冻存，不仅仅是低温生物学的问题，还涉及细胞生物学理论。从细胞的生理特性看,在-70℃以上,细胞内某些酶类还具备一定的活性,使细胞进行简单、缓慢的代谢,结果使细胞出现“衰老”现象。另外，温度的波动也会产生物理和化学反应，使细胞受到不同程度的损伤。细胞在-135℃下冻存,有效地避免了上述现象的发生。可见，细胞的冻存除考虑细胞内外水的冻结及冻结可能造成的损伤外,还要考虑细胞本身的生物学特性，否则就难以达到长,期保存的目的。
原创作者：智立中特（武汉）生物科技有限公司
