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细胞增殖实验操作步骤（MTT法）
点击次数：119 发布时间：2023/7/6 16:18:00
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(一)细胞增殖实验原理
MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,
5-di-phenytetrazoliumromide,MTT（噻唑蓝）为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可以用DMSO来溶解，利用酶标仪测定570 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
(二)细胞增殖实验操作（实用于贴壁细胞）
1.接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.
2.:培养细胞：同一般培养条件，培养2-3天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3.显色：分别培养不同时间，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
4.比色：选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
(三)细胞增殖实验结果
以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线或计算细胞生长抑制率、细胞相对增殖率等。
【细胞增殖实验注意事项】
1.选择适当得细胞接种浓度。
2.避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在显色后尽量吸尽孔内残余培养液。
3.设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，hou比色以空白调零。每组设定3复孔。
4.MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。
5.酶联免疫检测仪使用应打开电源预热半小时。
6.选择不同的波长，酶联免疫检测仪检测灵敏度不同。应根据实验目的选择相应的波长。
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