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细胞培养实验中应注意哪些问题
点击次数：59 发布时间：2023/6/12 15:38:34
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细胞培养常见问题及其解决办法
1.如何选用特殊细胞系培养基？
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。
2.何时须更换培养基？
视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
3.可否使用与原先培养条件不同之培养基？
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
4可否使用与原先培养条件不同之血清种类？
不能。血清是细胞培养上一个为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5何谓FBS,FCS,CS,HS?
FBS(fetal bovine serum)和FCS(fetal calf serum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS(calf serum)则是指小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。
6培养细胞时应使用5%或10%CO2？或根本没有影响？
一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10%CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5%CO2培养细胞。
7.Hank＇s蛋白酶(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank＇s蛋白酶(HBS)和Earle＇s蛋白酶(EBS)有什么本质的功能差别？
HBS和EBS的主要差别在于氢钠的水平,在Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。
8.细胞之接种密度为何？
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
9.悬浮性细胞应如何继代处理？
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复述步骤即可。
10.冷冻管应如何解冻？
取出冷冻管后，须立即放入37°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
11.细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？
除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
12.附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？
一般使用之trypsin-EDTA浓度为0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第,一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。
13.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg(约1,000rpm)，5-10分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。
14.细胞冷冻培养基之成份为何？
动物细胞冷冻保存时常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO(dimethyl sulfoxide)和90-95%原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用先行配制完成。
15.DMSO之等和无菌过滤之方式为何？
冷冻保存使用之DMSO等，必须为Tissue culture grade之DMSO(如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，第,一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C，避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO之Nylon材质滤膜。
16.冷冻保存细胞之方法？
冷冻保存方法一:冷冻管置于4°C 30~60分钟→(-20°C30分钟*)→-80°C 16~18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长,期储存。
冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3°C至–80°C以下，再放入液氮槽vapor phase长,期储存。*-20°C不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
17.细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial为宜。
18.培养基中是否须添加抗生素？
除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。
19.应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染好方法。
20.如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
原则上：直接灭菌后丢弃之。
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如霉素b和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2.分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，霉素b推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3.每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4.确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。
5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6.重复步骤4。
7.在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。
21.支原体(mycoplasma)污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？
不能。除有经验之家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
22.支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
23.侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
24.CO2培养箱之水盘如何保持清洁？
定期(至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
25.为何培养基保存于4°C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？
培养基保存于4°C冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。
原创作者：智立中特（武汉）生物科技有限公司
