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细胞转染的途径与方法-智立中特生物
点击次数：45 发布时间：2023/1/9 16:21:44
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细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术,它是研究基因表达调控，突变分析等的常规工具。细胞转染分为瞬时转染和稳定转染。瞬时转染是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到细胞的染色体上。稳定转染是指DNA整合到宿主细胞的染色体中。
细胞转染途径
（一）物理介导：电穿孔法、显微注射、基因枪
1.电穿孔法：
电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。本法需用特殊设置（电穿孔仪），把悬浮状态的受体细胞和供体DNA共同放入皿中（或杯中），再施以高压电脉冲，能够促进DNA通过细胞膜而进入胞内，并可整合到细胞的DNA中，使细胞发生转化。若转移的DNA为带有选择标记基因的质粒，也可在选择培养基中进行鉴定。
优点：转染效率较高
缺点：
1）需要昂贵的仪器（电穿孔仪）
2）对细胞的损害较大，每次转染需要更多的细胞和DNA
3）每种细胞电转的条件都需要进行多次优化：电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆转地伤害细胞膜而裂解细胞。
2.显微注射
本法是借助显微注射器直接把DNA注射入核内，使之发生整合入受体细胞基因组中的技术。本技术需要有严密无菌的净化室，以免敞开操作污染，同时要能有自动拉针仪以制备显微针，一般用手动拉针器拉制时要能使针末端有一个0.6cm长的细部，太长易折断，针尖开口为2-3μm间，针口小于1μm更佳，针尖开口大于5μm易刺伤细胞。
优点：转染效率较高，可用于稳定转染和瞬时转染。
缺点：在导入DNA时需要一个细胞一个细胞注射，不适合大量转染细胞研究的需要。适用于制备转基因动物
3.基因枪
基因枪依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内。可以将大分子导入细胞。
（二）化学介导：磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、多种阳离子物质介导
1.磷酸钙共沉淀法
磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混合，形成小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要。
优点：能用于任何DNA导入哺乳类动物，瞬时转染和稳定转染都可以。
缺点：
1）转染效率低：进入细胞的DNA只有1%-5%可以进入细胞核，其中只有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达。
2）重复性不佳：pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保,证质量，因为甚至偏离,优条件的十分之一pH都会导致转染失败。
2.脂质体转染
中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有欲先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。
脂质体（lipofectin regeant，LR）试剂是阳离子脂质体N-[1-2,3-Dioleyoxy,Propyl]-n,n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1:1(w/w)]。
脂质体转染的特点：
1）适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞，可用于瞬时转染和稳定转染。
2）转染效率高，比磷酸钙法高5-100倍。
3）能够把DNA盒RNA转染到各种细胞。
4）转染的稳定性好，可重复性高。
5）转染时,好不加血清和抗生素。
6）阳离子脂质体细胞毒性相对较高，对部分细胞可能会干扰细胞的代谢。
3.多种阳离子物质介导
DEAE-葡聚糖介导的转染，原理尚不清楚，可能是通过内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核，此法只适合暂时转染实验。不适用与稳定转染，转染时要除去血清。
（三）生物介导：原生质体转染、病毒介导的转染
病毒介导的转染，以病毒作为载体，通过病毒感染的方式将外源DNA导入到细胞中，其中以逆转录病毒及腺病毒转染体系为常用。
优点：整合效率高，可使外源基因在宿主细胞中长,期表达。适用于难以转染的原代细胞。
缺点：存在潜在的安全危险性。
1.逆转录病毒介导的转染
此系统包括重组逆转录病毒载体和包装细胞两个部分。当逆转录病毒载体进入包装细胞系时，载体基因就被包装形成完整的病毒颗粒，于是包装细胞系就成了制造病毒载体的生产细胞系。将靶细胞与生产细胞系共同培养或是收集含有载体病毒的生产细胞系上清液与靶细胞一起孵育，即可有效地进行基因转移。可以有效地整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。
优点：
1）转染谱广，可感染包括人体在内的多种动物细胞类型
2）一次可感染大量细胞，转染率可高达100%
3）转染的基因能够准确整合到宿主细胞基因组中，整合率高，且能长,期有效表达。
缺点：
1）载体的滴度较低
2）只能整合表达至分裂相细胞
3）容纳的外源基因量较少，不利于较大基因的插入（<8kb）
2.腺病毒载体的特点
1）在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因
2）能有效进行增殖，滴度高
3）不整合到染色体中，一般用于瞬时转染
理想的细胞转染
1.转染效率高，不影响细胞正常生理活动
2.细胞毒性小
3.重复性好
4.安全
5.方法简单
6.省时，经济
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