细胞培养操作细节大全

　　冷冻细胞活化

　　1.冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。

　　2.细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。3.材料

　　3.137oC恒温水槽3.2新鲜培养基

　　3.3无菌吸管/离心管/培养瓶3.4液氮或干冰容器4.步骤：

　　4.1操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

　　4.2自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

　　4.3将新鲜培养基置于37°C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。

　　4.4取出冷冻管，立即放入37°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%ethanol擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

　　4.5取出0.9ml解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。另取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。

　　4.6解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1,000rpm,5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。

　　4.7若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。

　　细胞传代培养

　　1.细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3至1:6，依细胞种类而异。2.材料：

　　2.1.无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,GibcoBRL21600-010)

　　2.2.trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：以10ml分装于15ml无菌离心管中，保存于–20oC，使用放在37oC水槽回温。

　　2.3.新鲜培养基

　　2.4.无菌吸管/离心管/培养瓶

　　3.步骤：

　　3.1.附着型胞(adherentcell)3.1.1.吸掉旧培养液。

　　3.1.2.用D-PBS洗涤细胞一至二次。

　　3.1.3.加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37oC作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液。)

　　3.1.4.轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

　　3.2.悬浮型细胞(suspensioncell)

　　3.2.1.吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。

　　3.2.2.吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。3.3.融合瘤(hybridoma)

　　3.3.1.有些hybridomacell需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。

　　细胞计数与活化测试

　　1.原理：

　　1.1.计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。1.2.血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。

　　1.3.存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypanblue染料，如果细胞不易吸收trypanblue，则用红色之Erythrosinbluish。2.材料：

　　2.1.0.4%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)2.2.Erythosinbluishstain

　　取0.1gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及0.05grampreservativemethylparaben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline2.3.血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)2.4.计数器(counter)2.5.低倍倒立显微镜

　　2.6.粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)3.步骤：

　　3.1.取50ml细胞悬浮液与50mltrypanblue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

　　3.2.取少许混合液(约15ml)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosinbluish)。

　　3.3.计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，，后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。4大格*细胞总数x2x104/4=细胞数/ml

　　*每一大格的体积=0.1cmx0.1cmx0.01cm=10-4ml

　　3.4.若不用血球计数盘，可用Coultercounter作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。3.5.范例：

　　T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1mltrypanblue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。

　　活细胞数/方格：55,62,49,59死细胞数/方格：5,3,4,6细胞总数=243

　　平均细胞数/方格=60.75稀释倍数=2

　　细胞数/ml：60.75x104x2=1.22x106细胞数/flask：1.22x106x10ml=12.2x106存活率：225/243﹦92.6%

　　细胞冷冻与保存

　　1.注意事项：

　　1.1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80–90％致密度。

　　1.2.冷冻检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存一至二日测试是否有抗体之产生。

　　1.3.注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂等，无菌且无色(以0.22micronFGLPTelflon过滤或是直接购买无菌产品，如SigmaD-2650)，以5~10ml小体积分装，4oC避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂等，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长，期储存后对细胞会有毒性。

　　1.4.冷冻保存之细胞浓度：

　　1.4.1.normalhumanfibroblast:1~3x106cells/ml

　　1.4.2.hybridoma:1~3x106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。

　　1.4.3.adherenttumorlines:5~7x106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1-3x106cells/ml。

　　1.4.4.othersuspensions:5~10x106cells/ml,humanlymphocyte须至少5x106cells/ml。

　　1.5.冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture，以防止冷冻失败。

　　1.6.冷冻方法：

　　1.6.1.传统方法:4oC10分钟－－->-20oC30分钟－－->-80oC16-18小时(或隔夜)－－->液氮槽vaporphase长，期储存。

　　1.6.2.程序降温：利用等速降温机以–1～-3oC/分钟之速度由室温降至–120oC，放在液氮槽vaporphase长，期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

　　2.材料：

　　2.1.生长良好之培养细胞

　　2.2.新鲜培养基

　　2.3.DMSO(SigmaD-2650)

　　2.4.无菌塑料冷冻保存管(Nalgene5000-0020)

　　2.5.0.4％w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)

　　2.6.血球计数盘与盖玻片

　　2.7.等速降温机(KRYO10SeriesII)

　　3.步骤：

　　3.1.冷冻一日更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。

　　3.2.配制冷冻保存溶液(使用配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，，后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。

　　3.3.依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻存活率。

　　3.4.离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5x106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完，全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。

　　3.5.冷冻保存方法1:冷冻管置于4oC10分钟→-20oC30分钟→-80oC16～18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长，期储存。

　　3.6.冷冻保存方法2:冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为:program7:HBCELL