细胞培养实验三要素

　　要素一、无菌实验技术

　　1.实验进行，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株的操作。

　　2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流流通。实验用品以75%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面的中央无菌区域，勿在边缘非无菌区域操作。

　　3.小心取用无菌的实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

　　4.工作人员应注意自身安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等的无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中，应避免引起aerosol的产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头的伤害等。

　　5.定期检测下列项目

　　5.1.CO2钢瓶的CO2压力。

　　5.2.CO2培养箱的CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。

　　5.3.无菌操作台内的airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。

　　6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750)，定期更换水槽的水。

　　

　　要素二、实验用品

　　1.种类

　　1.1.细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteurpipet外，其它均为塑料无菌制品。

　　1.2.TC培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask,plates,dishes,rollerbottle等，依实验需要使用。

　　1.3.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml

　　1.4.塑料离心管:15ml,50ml，均有2种不同材质，其中polypropylene(PP)为不透明材质，polystyrene(PS)为透明材质，可依实验需要而选择适合材质的离心管。

　　1.5.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉废弃培养液等。

　　1.6.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml,250ml,500ml,1000ml

　　2.清洗

　　2.1.新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05NHCl浸泡数小时，洗净后才开始使用。

　　2.2.用过的玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。

　　3.灭菌

　　3.1.实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃,15lb,20分钟，置于oven中烘干。

　　3.2.实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170℃,4小时。

　　3.3.液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高压灭菌121℃,15lb,20分钟处理。

　　

　　要素三、培养基

　　1.液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行放在37℃水槽中温热。

　　2.液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。

　　3.粉末培养基配制(以1升为例)：

　　3.1.细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基的配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH的误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。

　　3.2.材料

　　3.2.1.纯水(milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)

　　3.2.2.粉末培养基

　　3.2.3.NaHCO3(SigmaS-4019)

　　3.2.4.电磁搅拌器

　　3.2.5.无菌血清瓶

　　3.2.6.0.1或0.2mm无菌过滤膜

　　3.2.7.pHmeter

　　3.2.8.真空帮浦

　　3.2.9.CO2气体

　　3.3.步骤

　　3.3.1.取粉末培养基溶于700mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解。

　　3.3.2.称取适量的NaHCO3粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3-5分钟。

　　3.3.3.将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解的液体培养基中混合。混后溶液的pH应为7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH会升高0.1-0.2。

　　3.3.4.以0.1或0.2mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。(血清亦可加入培养基中一起过滤)

　　3.3.5.配制的培养基配制须作生长试验与污染测试。

　　4.配制培养基的生长测试

　　4.1.材料

　　4.1.1.MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)4.1.2.6-wellTCplate(or35mmTCdish)

　　4.1.3.methanol

　　4.1.4.glacialaceticacid

　　4.1.5.10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)

　　4.2.步骤

　　4.2.1.以待测试培养基培养MDCKcell，接种MDCK细胞于6-wellplate(或35mmTCdish)中，每个well接种1×102活细胞，同时作对照组实验。

　　4.2.2.接种5～7天后，在100倍倒立显微镜作观察细胞群落的生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。

　　4.2.3.去除培养基，加入1mlCarnoy＇s固定液(甲醇：冰醋酸?3:1)，室温下静置10min。

　　4.2.4.去除固定液，水洗二次。

　　4.2.5.加入1ml10%Giemsasolution，，室温下静置染色2-3min。

　　4.2.6.去除染液，水洗二次。

　　4.2.7.以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。