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细胞培养技术 （科学技术）和具体步骤
点击次数：39 发布时间：2022/7/25 13:31:58
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肖**
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智立中特生物细胞培养技术指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织（动物）。
培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。
优点
1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究.
2.直接观察细胞的变化可便于摄影。
3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。
4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。
5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。
6.易于施用物理、化学生物的实验研究。
7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。
8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。
缺点
组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完，全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。
具体步骤
1.细胞复苏
将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。将融化的细胞移入离心管中，加入37oC预热的DMEM完，全培养基中（其中胎牛血清约为10%），轻轻吹匀，离心，500g离心2min，弃上清液。
加入DMEM完，全培养基清洗，弃上清液。加入DMEM完，全培养基，轻轻吹打混匀，制成细胞悬液，接种于培养皿/瓶中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。
2.细胞传代
当细胞密度达到80%~90%（过早产量不足，过晚细胞状态不佳，1:2至1:10以上的比率传代培养，一般1:3至1:5细胞一代，即从细胞接种到分离再培养的一段时间，非细胞有丝分裂次数）时，去掉完，全培养基，用1XPBS清洗2次。
加入胰蛋白酶（注意：消化液的量以盖住细胞，好，，佳消化温度是37oC。显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度）进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。
加入适量DMEM完，全培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM完，全培养基清洗，弃上清液。
加入DMEM完，全培养基，轻轻吹打混匀，吸取10微升进行计数，然后按照所需细胞量在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。
3.细胞冻存
当细胞密度达到80%~90%时，去掉完，全培养基，用1XPBS清洗2次。加入胰蛋白酶进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。加入DMEM完，全培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM完，全培养基清洗，弃上清液。加入lml冻存液（90%胎牛血清，10%DMSO。一般来讲血清含量可以在10%-90%之间调整，冻存液中加入血清一方面可以为细胞提供营养，另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质，如蔗糖，白蛋白等从而更好地保护细胞），放入冻存管内（管内有异丙醇，以保，证温度降低的速度），立即放入4oC冰箱中冻存30min，然后放入-20oC冰箱中冻存30min，再置于-80℃冰箱内过夜。
第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。
细胞冻存和复苏的原则是：慢冻速融，这样更加有利于保持细胞的活力。冻存细胞不加任何保护剂，会导致细胞内冰晶的产生，从而使细胞产生内源性的机械损伤，引起细胞内环境渗透压，PH，电解质等的改变，进而促使细胞死亡。
原创作者：智立中特（武汉）生物科技有限公司
