ELISA实验常见问题及解决方案

问题

序号

可能原因

解决方法

显色淡，灵敏度偏低

1

试剂盒未充分平衡

试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）

2

样品不适合做ELISA检测

样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件（例如稀释液的成分）

3

酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥

防止板过于干燥

4

包被抗体遭到破坏

操作温和，移液枪不能碰到孔底

5

样本和抗体孵育条件不合适

按照说明书条件，建议孵育过程中全程振荡孵育。

6

洗涤浸泡时间过长

按照说明书操作。勿人为增加浸泡时间；

7

偶联HRP试剂污染

弃去试剂，重新配置

8

错误的稀释偶联HRP试剂

弃去试剂，重新配置

9

TMB底物孵育时间过短，因非人为因素影响，需要优化孵育时间

确定合适的孵育时间：人为判定-zuigao浓度的标准品出现深蓝色；S4-5有淡蓝色；机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65

10

样本浓度过高或存在基质效应

建议做不同稀释倍数，确认样本zuijia稀释倍数。

11

酶标仪滤光片设置有问题或者波长选择不对

确认仪器设置及选择正确的波长检测。

12

酶标板不适合做ELISA

不能使用细胞培养板，建议使用ELISA用高吸附力板子。

背景深，全部呈有色（通常的Elisa背景值OD<0.2）

1

洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留

洗液zhunque配制；充分洗涤，静置15，chedi拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。

2

底物污染，未避光保存，出现颜色

弃去底物，重新配置

3

样品稀释液污染

弃去稀释液，重新配置

4

吸头重复使用，未洗净或消毒不chedi

吸头尽可能一次性使用

5

不正确的孵育时间，温度（尤其是底物孵育的时间）

为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。wanquan按照说明书要求。

6

偶联抗体（streptavidin-HRP）浓度过高

按照说明书调整到zuijia的浓度

7

ELISA板子不正确的贮存

酶标板贮存于2-8 ℃；使用结合力低点的Elisa板

8

没有正确封闭

在标准品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间

9

样本溶血严重

建议使用非溶血或轻微溶血样本，严重溶血样本会导致背景偏高。

重复性不佳，高CV值

1

样品不均一

加样充分混匀样品，取样确保移液位置一致；

2

包被板表面遭到破坏

洗板加样时尽量小心，避免破坏板的包被表面

3

孔与孔之间的交叉污染

孵育后取下盖子小心操作，避免孔与孔的污染；封板膜不能重复使用

4

加样量不一致

样品稀释应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴

5

边缘效应（外周孔显色较中心孔深）

孵育时尽量100 rpm旋转混匀

6

微量加样不zhunque

baozheng微量加样的zhunque性和均一性

7

不正确的洗涤

洗液zhunque配制；充分洗涤，静置15，确定每一步的洗涤

出现白板，阳性对照不显色

1

显色液变质

更换新的显色液

2

洗涤液配制有误

请按说明书所示稀释倍数配制

3

未加酶结合物而认为已加入

注意不要漏加

4

终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用

每次加液均应看清标签

5

标准品稀释方法错误/或标准品有问题

请按照说明书所示配置说明书，注意单位和稀释倍数

6

不同试剂盒或不同批号的试剂混用

建议使用同批次试剂盒。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。

不正常的标准曲线

1

错误的方法重悬标准品

加入正确量的溶液重悬标准品，重悬充分

2

标准品稀释错误

按照说明书要求稀释标准品

3

标准品污染

使用一次性的灭菌吸头， 标准品贮存于2-8 ℃

4

错误的倍比稀释步骤

按照说明书倍比稀释标准品

5

波长选择错误

TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而 者比色波长为450nm，后者为492nm。双波长比色分析优于单波长。

6

标准品混用

不同批号试剂勿混用

7

试剂盒在运输途中时间太长，温度太高，标准品失活

尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温

8

ELISA未终止而直接检测450nm和620nm

TMB显色需终止后检测，否则会出现620nm比450nm读数高的现象。（数值仍有梯度规律）

样品或标准品OD超出正常范围

1

错误的样品或标准品的稀释

wanquan按照说明书稀释

2

偶联抗体浓度过高

按照说明书调整到zuijia的浓度

3

TMB底物孵育时间过长

调整到合适的孵育时间

4

样品或标准品污染

避免污染

5

错误的孵育时间或温度

wanquan按照说明书

6

孵育时未加盖导致溶液挥发和污染

贴封片或加盖

标曲很好，但是样本无法计算到数值

1

标曲选择不合适

选择合适的标曲拟合；

2

样本含量很低，低于灵敏度无法被检测到

尝试浓缩样本或使用高敏elisa试剂盒检测

3

样本含量很高，超过标曲

建议进行预实验摸索稀释倍数，确保样本OD值落在标曲范围内

标曲高浓度间无明显趋势

1

如OD绝对值靠谱，但是仅无梯度，则显色过度

TMB显色体系中建议根据S1，S2颜色进行判断，当S1，S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。

2

仅作单波长检测。

由于参考波长读取非特异性检测，如指纹、划痕、水渍等，对结果也有影响。建议终结果以双波长为zhunque。