PCR五要素及引物设计一般原则

 PCR反应体系由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反应缓冲液体系组成。

PCR反应五要素：

参加PCR反应的物质主要有五种即：

　　引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。

　　引物有多种设计方法，由PCR在实验中的目的决定，但基本原则相同。PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。

　　模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制

　　缓冲液的成分为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构

设计PCR引物时的一般原则：

1、引物长度一般15~ 30碱基，过短则特异性低; 过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。

2、避免内部二结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。

3、G/C 和A/T 碱基均匀分布，G/C 含量在45%~ 55% 之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免嘌呤、嘧啶的连续排列。

4、要避免两个引物间特别是3＇ 末端DNA 序列互补以及同一引物自身3＇ 末端的序列互补，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。

5、引物3＇ 端碱基一般应与模板严格配对，并且3＇ 端为G、C 或T 时引发效率较高。