引物设计的原则和注意事项汇总

 引物设计的原则和注意事项：

1、引物的长度一般为15-30 bp，zui好在18~24 bp，因为太短易形成错配（False priming） 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量。

2、引物在模板内zui好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。

3、引物序列的GC 含量zui好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端zui后5个碱基zui好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。

4、DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向 3’端递减，3’端AGzui好不要高于9．0 keaf mol。

5、避免形成稳定的引物二聚体（Dimer ａnd Cross DimeO 和发夹结构（Hairpin），AG高于4．5 keal／mol时易引发 上述两种结构的产生。

6、引物所在的模板区域应该位于外显子区，zui好跨越一个内含子区，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。

7、如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。而以mRNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。

8、5’ 端对PCR影响不太大，可以引进修饰位点和标记物。

只要掌握了以上原则和注意事项，我们可以在软件和程序设计的一组引物中筛选出几对我们需要的目标引物。常用到的引物设计软件有Primer Premier 5和Oligo 6、primer3。