培养细胞蛋白提取流程

1、 贴壁培养的细胞，吸去培养基后，加入 10mL/150mm 培养板的冷 PBS 洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液；

2、  悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞，将细胞及培养液移至离心管中，1000 转/分离心 10 min，再用10mL/150mm 培养板的冷 PBS，1000 转/分离心 5 min 洗两次；

3、 在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10μL 磷酸酶抑制剂，1μL 蛋白酶抑制剂和 10μL PMSF（用户自配：浓度 100mM， 溶于异丙醇），混匀。冰上保存数分钟待用；

4、 在上述培养板或离心管的细胞中，加入上述配制好的冷 Lysis Buffer；

5、冷室或冰上操作，贴壁细胞用细胞刮子刮下，皆 Lysis Buffer 一同转移至新的预冷的离心管中；悬浮培养或裂解刮下的贴壁细胞皆 Lysis Buffer 一同转移至新的预冷的离心管中；

6、置于 4℃摇床平台上，温和振荡 15 min；

7、14,000rpm，4℃离心 15min，取上清为全蛋白提取物, 蛋白定量（Bradford 法、BCA 法）；

8、  分装保存于-70℃,避免反复冻融。

注意事项:所有接触样品的用具及试剂均需预冷。我们在提取蛋白后，如有必要，可透析除去表面活性剂。