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PCR引物的设计原则
点击次数：328 发布时间：2022/11/1 16:12:25
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蔡**
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PCR引物的设计原则:
1、引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
2、 产物不能形成二结构。
3、引物长度一般在15~30碱基之间。
4、G+C含量在40%~60%之间。
5、碱基要随机分布。
6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8、引物5′端可以修饰。
9、引物3′端不可修饰。
10、引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1、引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2、避开产物的二结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二结构的影响，选择扩增片段时好避开二结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3、长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer.引物的有效长度：Ln=2(G+C)+(A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的适温度(74℃)，不能保证产物的特异性。
4、G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值好接近72℃以使复性条件佳。
5、碱基随机分布
引物中四种碱基的分布好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6、引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp.
7、引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8、引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二结构可能，除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中，引物3′端不能发生错配。
在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP(四种dNTP各200μmol/L)以质粒(103拷贝)为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100.引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。
9、引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物su、荧光、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
10、密码子的简并
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
原创作者：上海研尊生物科技有限公司
