3-磷酸甘油酸激酶（PGK）活性检测试剂盒 （紫外分光光度法）

3-磷酸甘油酸激酶（PGK）活性检测试剂盒

（紫外分光光度法）

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

产品货号：BA1003

产品规格：50管/48样

产品内容：

提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体25mL×1瓶，4℃避光保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加5mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加2.5 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂四：粉剂×3支，-20℃避光保存。临用前加1mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂五：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加10 mL蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

产品说明：

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，也是生物得以生存的关键酶。广泛存在于动植物和微生物体内，具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。

3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸，引起340nm处的吸光度下降，即反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

血清/血浆：直接检测。

二、测定步骤：

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 工作液的配制：按照蒸馏水：试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=6:10:2:1:1:4的体积比例充分混匀，现用现配。

3、 操作表：在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂：

三、PGK活性计算：

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PGK（U/mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(V样×Cpr) ÷T＝321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PGK（U/g鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(W×V样÷V样总) ÷T＝321.54×ΔA÷W

（3）按液体体积计算：

酶活单位定义：每mL血清（浆）每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PGK（U/g鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷V样÷T＝321.54×ΔA÷W

（4）按细胞数量计算：

酶活单位定义：每10⁴个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PGK（U/g鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷(500×V样÷V样总)÷T＝0.643×ΔA÷W

V反总：反应体系总体积，1×10^-3L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；

V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：500万个细胞；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项：

1、△A大于0.8或者A1测定小于0.9时，建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当△A小于0.01时，可以延长反应时间（10min或15min）或增加样本体积来测定。

2、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.01。

3、样品的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有较高的蛋白浓度（约10mg/mL），所以测定样品蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。

原创作者：上海尚宝生物科技有限公司