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几丁质酶活性检测试剂盒（可见分光光度法）
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注意：正式测定务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
产品货号：BA1176
产品规格：50管/24样
产品简介：
几丁质酶要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)，以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成为抗真菌病害的研究热点。
几丁质酶水解几丁质产生 N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与 3,5-二硝基水杨酸产生棕红色化合物，在540nm处有特征吸收峰，吸收值增加速率反映了几丁质酶的活性。
产品内容：
提取液：液体80mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存，使用摇匀。
试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。
标准品：粉剂×1瓶。5mg N-乙酰氨基葡萄糖，4℃保存。临用加入2.27mL蒸馏水配成10μmol/mL的标准溶液。
需自备的仪器和用品：
天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：
一、粗酶液提取
1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积 (mL)为 1：5~10的比例（建议称取约0.15g组织，加入1.5mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。
2、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议750万细胞加入1.5mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7 s，总时间3min）；然后12000rpm，4℃，离心20min，取上清置于冰上待检。
3、培养液：直接测定。
二、测定操作表
1、可见分光光度计预热30min。波长调至540nm，蒸馏水调零。
2、将标准溶液稀释为4、3、2.5、2、1μmol/mL 的标准溶液备用。
3、在EP管中分别加入：
| 试剂名称（mL） | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
| 样品 | 0.5 | 0.5 | - | - |
| 标准溶液 | - | - | 0.5 | - |
| 蒸馏水 | - | - | - | 0.5 |
| 试剂一 | 0.5 | - | 0.5 | 0.5 |
| 混匀，37℃水浴1h，沸水浴5min。 | ||||
| 试剂一 | - | 0.5 | - | - |
| 8000rpm常温离心10min，分别取上清液0.8mL于新的EP管中。 | ||||
| 试剂二 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 混匀，沸水浴反应10min，立即置于冰上至室温。测定每管在540nm下的吸光度，记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA测定=A测定管-A对照管，ΔA标准=A标准管-A空白管。 | ||||
三、计算公式
1、标准曲线的绘制：
以ΔA 标准为y轴，标准溶液浓度为x轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b。将ΔA测定带入标准方程中，得到 x（μmol/mL）
2、几丁质酶活的计算：
（1）按照样本重量计算
酶活性定义：37℃下，每g组织每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性（U/g 鲜重）=x×V样÷（V样÷V样总×W）÷T=1.5x÷W。
（2）按照蛋白质浓度计算
酶活性定义：37℃下，每mg蛋白每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性（U/mg prot）=x×V样÷（V样×Cpr）÷T =x÷Cpr。
（3）按照细胞数量计算
酶活性定义：37℃下，每104个细胞每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性（U/104cell）=x×V样÷（V样÷V样总×细胞数量）÷T =1.5x÷细胞数量。
（4）按照培养液体积计算
酶活性定义：37℃下，每mL培养液每小时分解几丁质产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性（U/mL）=x×V样÷V样÷T =x。
V样：反应体系中样本体积，0.5mL；V样总：加入提取液体积，1.5mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，1h；细胞数量：以104为单位，万个。
注意事项：
1、反应结束后尽快进行比色。
2、OD值大于1.5，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数；或者缩短37℃水浴时间到X小时（如0.5 小时），按照原先计算公式得到的结果再除以X。
原创作者：上海尚宝生物科技有限公司
