EdU apollo 567in vitro kit EdU细胞增殖检测试剂盒（成像检测）

产品货号: BA1987

产品规格: 100T

产品简介：

EdU（5-Ethynyl-2’- deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，可快速准确的检测细胞的增值能力。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU与T非常相似，而EdU染料只有BrdU抗体的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等），可有效避免样品损伤，而且无需抗原抗体反应， 能在细胞和组织水平更准确地反映DNA复制活性。

本试剂盒适用于体外培养细胞的增值检测。贴壁细胞宜采用荧光检测方式，适用于荧光显微镜、 共聚焦显微镜、高内涵筛选仪检测。悬浮细胞可在孵育EdU后进行涂片，涂片后从固定开始跟贴壁细胞采用相同的染色检测流程。

产品组成：

实验准备：

1. 1×PBS (pH 7.2~7.6)

2. 渗透剂(含0.5% Triton X-100的PBS)

3. 甘氨酸溶液(2mg/mL)（去离子水配置）

4. 细胞固定液(含4%多聚甲醛的PBS)

5. 96/24/12/6孔培养板或培养皿等

注意：请使用一次性手套，废液请妥善处理。

操作步骤（仅供参考）：

荧光显微镜检测方法（以96孔板，A549贴壁细胞为例）

1、EdU标记

1.1 用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液 (试剂A)，制备适量50μM EdU培养基；

1）EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<2h）宜采用高浓度（10-50μM），长时间孵育（>24h）宜采用低浓度（1-10μM）;

2）如果需配置10μM EdU培养基，需调整为5000：1稀释比例；

3）配置好的培养基建议现配现用。

1.2 每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基；

1）孵育时间与细胞周期相关（附表），大多数肿瘤细胞系均可采用2小时孵育时间；

2）EdU培养基用量以没过细胞为宜，但需EdU孵育时间内的营养物质持续供给；

1.3 PBS清洗细胞1-2次，每次5分钟。

注：清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。

2、细胞固定化

2.1 每孔加入50μL细胞固定液 (即含4%多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液；

1）低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，

2）可采用其他方式进行细胞固定。

2.2 每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；

注：目的是中和多聚甲醛，反应体系；

当采用其他方式进行细胞固定时可酌情省略此步骤；

2.3 每孔加入100μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；

2.4 每孔加入100μL 渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟。

注：当实验需要进行其他抗体染色时，或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，可能需要增强细胞膜通透性。

3、Apollo染色

3.1 每孔加入100μL的1×Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；

1）染色液用量与细胞量相关，以覆盖细胞为宜；

2）孵育时间可以进行适当调整，调整范围为10-30分钟。

3.2 加入100μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS) 脱色摇床清洗2-3次，每次10分钟，弃渗透剂；

3.3 （可选）每孔每次加入100μL甲醇清洗1-2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。

注：由于某些细胞对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景。

4、DNA染色

4.1 用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；

4.2 每孔加入100μL 1×Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；

4.3 每孔每次加入100μL PBS清洗1-3次；

4.4 客户可选择进行其他染色步骤，否则每孔加入100μL PBS保存待用。

建议染色完成后立即进行观测；如果条件限制，请避光4℃湿润保存待测，但不应超过3天。若为细胞爬片或涂片，可使用抗荧光淬灭封片剂封片后4℃保存及进行检测。

实验参考：

表1 EdU孵育时间设定参考

注：1）EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用2h孵育时间；

2）考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，细胞周期会有所变化。

表2 EdU培养基及染色反应液的使用量参考

表3 Apollo染色反应液的配置参考（现用现配）

注：1）按顺序配制适量1× Apollo染色反应液，以免破坏正常的反应体系(现用现配，30分钟用完)；

2）试剂E为白色粉末，较难准确称量，称量误差范围可稍微放宽，但不应超过±20%。且其较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需报废或更换。

保存条件：室温运输，2-8℃储存，勿冻存，荧光试剂请避光保存，可稳定储存一年。

FAQ：

1. 什么样的信号才是真正的EdU阳性信号？

1）Apollo染色信号与核酸染色信号（Hoechst 33342或DAPI等核染信号）重合，或者与核重合的信号明显强于胞浆上的信号（染料附着等）

2）一般部分细胞上的信号呈现上述特征，而不是全部细胞。

2. 整个细胞都有EdU信号，或背景信号很强。

1）染色后洗涤不充分，可尝试加强洗涤解决。

2）染色过程中干片，导致染料粘附严重。

3）多聚甲醛固定时间过长而未使用甘氨酸中和。

4）没有阳性信号曝光过度导致背景严重。

3. 没有阳性信号。

1）EdU处理时间太短导致没有阳性信号。体外细胞实验一般EdU处理时间宜为细胞周期长度的1/5-1/10，阳性率约为20%-30%，体内实验需根据目的组织细胞的增值速度进行调整，若细胞增值速度慢，需要采用长时间的EdU处理时间，

2）对于阴性结果，可设置阳性对照（常见肿瘤细胞株如Hela EdU处理2小时或者EdU处理6小时以上的小鼠小肠上皮组织）以确认染色过程无误，对于目的样品，可使用较长的EdU处理时间以尽量先检测出信号，再根据具体信号比例进行EdU处理时间的调整。

3）染色过程干片，导致染料粘附严重

4. 细胞中表达GFP，Apollo染色后检测不到GFP的荧光信号。

Apollo染料会造成GFP的失活，故Apollo染色后无法直接检测GFP，建议可以使用GFP抗体进行复染医间接检测GFP。

原创作者：上海尚宝生物科技有限公司