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氨基酸（AA）检测试剂盒（茚三酮微板法）
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产品货号：BA1551
产品规格：100T
产品简介：
氨基酸(Amino acid，AA)是组成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。动物肝脏、肾脏是氨基酸代谢的主要器官，故尿中氨基酸的变化能反应肝、肾的生理状态，植物体内氨基酸含量对研究植物在不同条件下及不同生长发育时期氮代谢变化、植物对氮素的吸收、运输、同化及营养状况等有重要意义。另外，氨基酸还能反映灼伤、伤寒等方面情况。
氨基酸(AA)检测试剂盒(茚三酮微板法)(Amino Acid Assay kit)检测原理是在弱酸条件下，氨基酸与茚三酮共热情况下能定量的产生蓝紫色的二酮茚胺(又称Ruhemans紫)，其吸收峰在波长570nm处，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与氨基酸浓度成正比，该试剂盒主要用于检测血清、尿液、植物组织、食品、药品等中的总游离氨基酸含量。该试剂盒仅用于科研域，不宜用于临床诊断或其他用途。
产品组成：
| 试剂(A):氨基酸标准(50μg/ml) | 1ml | 4℃ |
| 试剂(B):AA Lysis buffer | 250ml | 室温 |
| 试剂(C):茚三酮显色液 | 5ml | 室温 避光 |
| 试剂(D):AA Assay buffer | 1ml | 室温 |
| 试剂(E):维生素C | 2支 | 室温 |
| 使用说明书 |
| 1份 |
需自备的仪器和用品：
1. 无氨蒸馏水或去离子水
2. 研钵或匀浆器
3. 离心管或试管
4. 水浴锅或恒温箱
5. 60%乙醇
6. 96孔板、酶标仪
操作步骤： (仅供参考) ：
1. 准备样品：
①植物样品：取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，切碎，迅速称取0.4g，按植物组织：AA Lysis buffer=0.4g：2.0ml的比例加入AA Lysis buffer匀浆或研磨，用无氨蒸馏水稀释至40ml，混匀，用滤纸过滤，滤液即为氨基酸粗提液，4℃保存备用。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，-20℃冻存，用于氨基酸的检测。
③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用AA Lysis buffer进行适当匀浆，1000g离心5min，留取上清即为氨基酸粗提液，4℃保存备用，用于氨基酸的检测。
④高浓度样品：如果样品中含有较高浓度的氨基酸，可以使用AA Lysis buffer进行恰当的稀释。
2. 配制茚三酮工作液: 取适量的茚三酮显色液、AA Assay buffer，按茚三酮显色液：AA Assay buffer=35：3的比例混合，即为茚三酮工作液，4℃避光密闭保存，2周有效。
注意：AA Assay buffer所含物质浓度较高，且有刺激性，如有结晶或沉淀，应于40~70℃密闭温育，使其溶解后使用。
3. 配制维生素C工作液: 取出1支维生素C，准确溶解于10ml无氨蒸馏水，混匀，4℃预冷备用，-20℃保存1周有效。该试剂盒提供的维生素C及其配制的工作液为过量。
4. 配制系列氨基酸标准溶液：取出氨基酸标准(50μg/ml)恢复至室温后，以氨基酸标准(50μg/ml)按下表继续稀释：
| 加入物(ml) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 氨基酸标准(50μg/ml) | 0.008 | 0.016 | 0.024 | 0.032 | 0.04 |
| 无氨蒸馏水 | 0.992 | 0.984 | 0.976 | 0.968 | 0.960 |
| 含氮量(μg) | 0.4 | 0.8 | 1.2 | 1.6 | 2 |
5. AA加样：取1.5ml离心管，按照下表设置空白管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的氨基酸浓度过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测能设置平行管。
| 加入物(μl) | 空白管 | 标准管 | 测定管 |
| 无氨蒸馏水 | 30 | — | — |
| 系列氨基酸标准(1~5号管) | — | 30 | — |
| 待测样品 | — | — | 30 |
| 茚三酮工作液 | 45 | 45 | 45 |
| 维生素C工作液 | 15 | 15 | 15 |
| 混匀，80℃中加热20min，迅速冷却。 | |||
6. AA测定：加60%乙醇210μl，混匀。置于96孔板中，空白调零，酶标仪测定标准管、测定管570nm处吸光度(记为A标准、A测定 ) 。
计算：
以系列氨基酸标准(1~5号管)含氮量为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据测定管的吸光度进而计算其含氮量。根据如下公式计算具体样品中氨基态氮的含量：
植物组织样品 AA(μg/g)=C×VT /(W×VS )
式中：C=从标准曲线上查得的氨基态氮含量(μg)
VT =样品稀释的总体积(ml)=40(ml)
W=样品鲜重(g)
VS =测定时加入样品体积(ml)=0.03(ml)
血清、尿液等样品 AA(μg/ml)=C×N/VS
式中：C=从标准曲线上查得的氨基态氮含量(μg)
N=稀释倍数
VS =测定时加入样品体积(ml)=0.03(ml)
注意事项：
1. 实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即使用，应存于4℃。
2. 实验中用水尽量不被氨污染，否则会强烈干扰反应。
3. 如果样品中含有大量蛋白质或多肽也会影响结果的准确性，应先用蛋白沉淀剂去除而后检测，一般常用乙酸、磺基水杨酸、三等作为沉淀剂。AA Lysis buffer有蛋白沉淀剂的功能。
4. 氨基酸与茚三酮显色反应可用沸水浴15min，但易退色；在80℃水浴中孵育，并适当延长反应时间，可增强显色效果。产生的蓝紫色产物在1h内保持稳定，建议尽快检测。
5. 脯氨酸或羟脯氨酸的检测，建议使用脯氨酸(PRO)检测试剂盒(茚三酮比色法)。
6. AA Lysis buffer和AA Assay buffer有腐蚀性和挥发性，应小心操作，同时应密闭保存，防止挥发。
7. 空气中的氧有可能干扰显色反应，尽量隔绝空气。
8. 加入维生素C可提高反应的灵敏度，并使颜色稳定，但加入过量，将导致吸光度人为偏大，应严格掌握加入的量。
9. 如果没有酶标仪，也可以使用分光光度计测定，但应考虑分光光度计的小检测体积。
10. 所测样品的浓度过高时，应用 AA Lysis buffer稀释样品后重新测定。
有效期：6个月有效。4℃运输，4℃保存。
原创作者：上海尚宝生物科技有限公司
