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谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性检测试剂盒 （可见分光光度法）
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（可见分光光度法）
产品货号：BA1115
产品规格：50管/24样
产品简介：
谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px/GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GPX能够催化还原型谷胱甘肽（GSH）生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物。
GPX催化H2O2氧化GSH，产生GSSG，GSH能与DTNB生成在412nm处有特征吸收峰的化合物，412nm下吸光度的下降即可反应GPX的活性。
注意：实验之建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
产品内容：
| 试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
| 提取液 | 液体40mL×1瓶 | 2-8℃ |
| 试剂一 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃ |
| 试剂二 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃ |
| 试剂三 | 液体20 μL×1支 | 2-8℃ |
| 试剂四 | 液体60mL×1瓶 | 2-8℃ |
| 试剂五 | 液体15mL×1瓶 | 2-8℃ |
| 试剂六 | 液体15mL×1瓶 | 2-8℃ |
| 标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃ |
溶液的配制：
1. 试剂一：临用加入5.5mL蒸馏水溶解；
2. 试剂二：临用加入6.6mL蒸馏水充分溶解待用；
3. 试剂三：液体置于试剂瓶内EP管中。临用按1μL试剂三：1mL蒸馏水的比例稀释试剂三，现用现配；
4. 试剂四：瓶底若有结晶可50℃水浴溶解，此溶液为饱和溶液，若底部终还有结晶，吸取上清使用即可；
5. 标准品：10mg还原型谷胱甘肽。临用加入1.62mL蒸馏水溶解为20μmol/mL的标准溶液备用。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、天平、台式离心机、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管。
操作步骤：
一、粗酶液的提取：
1. 组织：按照组织质量（g）:提取液体积(mL)为 1：5~10的比例（建议称取0.05g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测(如上清不清澈，再离心3min)。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量104个：提取液体积（mL）500~1000:1的比例，建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（率300w，超声3 s，间隔7s，总时间3min）然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置冰上待测(如上清不清澈，再离心3min)。
3. 血清（浆）等液体：直接测定。
二、测定步骤：
1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。
2. 将20μmol/mL标准液用提取液稀释为0.2μmol/mL的标准溶液。再吸取100μL标准溶液与400μL试剂四混匀待用，此标准液混合物的浓度为0.04μmol/mL。标准液混合物现用现配。
3. 样本混合物：将150μL样本与150μL试剂一混合后室温放置5min。
4. 操作表：(在1.5mL离心管中依次加入下列试剂)
|
| 测定管 | 对照管 |
| 样品混合物（μL） | 100 | - |
| 试剂二（μL） | 100 | 100 |
| 37℃下预热5min | ||
| 试剂三（μL） | 100 | 100 |
| 37℃下反应5min | ||
| 试剂四（mL） | 1 | 1 |
| 样品混合物（μL） | - | 100 |
4000rpm常温离心5min，取上清。
| 试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
| 蒸馏水 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 提取液 | - | - | - | 100 |
| 上清液 | 500 | 500 | - | - |
| 标准液混合物 | - | - | 500 | - |
| 试剂四 | - | - | - | 400 |
| 试剂五 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| 试剂六 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| 混匀后尽快测定412nm下的吸光度，分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算△A测定=A对照管-A测定管，△A标准=A标准管-A空白管。 | ||||
三：GPX活性计算：
1. 抑制百分率的计算
抑制百分率＝(A对照管-A测定管) ÷（A对照管-A空白管）× 100%
尽量使样品的抑制百分率在30-70%范围内，越靠近50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样品；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样品。
2. GPX活性计算
（1）按蛋白浓度计算
活力单位定义：每mg蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol GSH氧化定义为一个酶活力单位。
GPX (U/mg prot) =ΔA测定÷（△A标准÷C标）×1000×V酶促÷（Cpr×V样）÷T
=208×ΔA测定÷△A标准÷Cpr。
（2）按样本鲜重计算
活力单位定义：每g样品在反应体系中每分钟催化1nmol GSH氧化定义为一个酶活力单位。
GPX (U/g 鲜重)= ΔA测定÷（△A标准÷C标）×1000×V酶促÷(V样÷V样总×W)÷T
=208×ΔA测定÷△A标准÷W。
（3）按细胞数量计算
活力单位定义：每104个细胞在反应体系中每分钟催化1nmol GSH氧化定义为一个酶活力单位。
GPX (U/104 cell)= ΔA测定÷（△A标准÷C标）×1000×V酶促÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T
=208×ΔA测定÷△A标准÷细胞数量。
（4）按液体体积计算
活力单位定义：每毫升液体在反应体系中每分钟催化1nmol GSH氧化定义为一个酶活力单位。
GPX (U/mL)= ΔA测定÷（△A标准÷C标）×1000×V酶促÷V样÷T=260×ΔA测定÷△A标准。
C标：标准液混合物的浓度：0.04μmol/mL；V酶促：酶促反应体系体积，1.3mL；V样：样本混合物中含有的样本体积，0.05mL；V样总：提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；T：反应时间，5min；细胞数量：以万计；W：样品质量，g；1000：换算系数，1μmol=1000nmol。
注意事项：
1. 吸光度若大于1.2时，建议将样本用提取液稀释后进行测定。
2. 建议一次不要做过多样本以免检测时间过长影响显色，使测定不准确。
原创作者：上海尚宝生物科技有限公司
