海藻糖酶（THL）试剂盒（微量法）

注意：正式测定务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

产品货号：BA1163

产品规格：100管/48样

产品简介：

THL（EC 3.2.1.28）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。海藻糖酶主要功能在于生物体分解海藻糖生成葡萄糖而直接用于能量供应。

采用3.5－二硝基水杨酸法测定THL催化海藻糖产生的还原糖的含量。还原糖与3.5－二硝基水杨酸共热生成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比，由此判断THL活性的高低。

产品内容：

提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶 ，4℃保存，用时加入2mL试剂一，充分溶解待用；

试剂三：液体13mL×1 瓶，4℃保存；

试剂四：液体13mL×1 瓶，常温保存；

标准品：粉剂×1支，4℃保存，含10mg无水葡萄糖（干燥失重<0.2%），临用加入1ml蒸馏水溶解备用，4℃可保存1周，或者用饱和苯甲酸溶液溶解，可保存更长时间。

标准品准备：将标准品用蒸馏水稀释至1、0.8、0.6、0.4、0.2mg/ml。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样品测定的准备：

1、细菌或细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液充分匀浆以破碎并裂解细胞（功率20％，超声3S，间隔10S，重复30次）；8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：称取约0.1g组织加入1mL提取液，冰浴中匀浆。8000g ，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）的处理：吸取约0.1mL血清（浆），加入1mL提取液，冰浴中匀浆。8000g ，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、调节水浴锅至95度。

3、加样表（在EP管中依次加入下列试剂）：

混匀，100℃煮沸5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中测定540nm处测定管吸光值。计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管均需设立一个对照管。

根据标准管浓度和吸光度建立标准曲线，x为吸光度，y为标准品浓度（mg/mL）。

三、THL活力计算：

1、按照蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。

THL活力（U /mg prot）＝1000× y÷÷T÷Cpr =100× y ÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。

THL活力（U /g 鲜重）＝1000×y÷T÷(W÷V样总)=100 ×y÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。

THL 活力（U /10⁴ cell）＝1000×y÷T÷(500÷V样总)=0.2 ×y

4、按血清（浆）体积计算

单位的定义：每mL血清（浆）在反应体系中每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。

THL 活力(U/mL)=1000×y÷T÷(V样÷V样总)=1000×y。

1000：1mg/mL=1000µg/mL；T：反应时间，10min；V样：加入血清（浆体积），0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

原创作者：上海尚宝生物科技有限公司