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磷酸果糖激酶（PFK）活性检测试剂盒（紫外分光光度法）
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产品货号：BA1194
产品规格：50管/48样
产品简介：
PFK（EC 2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖-1,6 二磷酸和ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。
PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PFK活性。
注意：实验之建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
产品内容：
| 试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
| 提取液 | 液体60 mL×1瓶 | 2-8℃ |
| 试剂一 | 液体40 mL×1瓶 | 2-8℃ |
| 试剂二 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
| 试剂三 | 液体45μL×1瓶 | -20℃ |
| 试剂四 | 液体20μL×1瓶 | 2-8℃ |
溶液的配制：
1. 试剂二：临用加入2.8mL双蒸水充分溶解备用；-20℃分装保存一周；
2. 试剂三：液体置于试剂瓶内EP管中。临用根据用量按照试剂三:蒸馏水为2:13 的体积比例充分混匀， 现用现配；用不完的试剂三原液建议-20℃分装保存，避免反复冻融；
3. 试剂四：液体置于试剂瓶内EP管中。临用根据用量按照试剂四:蒸馏水为4:65的体积比例充分混匀，现用现配； PFK工作液（可测25个样）的配制：取19mL试剂一和1.26mL试剂二充分混匀，现用现配。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本的处理
1. 细菌、细胞或组织样品的制备
细菌或细胞处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织处理：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2. 血清（浆）样品：直接检测。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2. 操作表
| 试剂名称（μL） | 测定管 |
| PFK工作液 | 800 |
| 样本 | 30 |
| 试剂三 | 5 |
| 试剂四 | 5 |
将上述试剂按顺序加入1mL石英比色皿中，加样本的同时开始计时；在340nm波长下记录20时的初始吸光度A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中，准确反应10分钟；迅速取出比色皿并擦干，340nm下比色，记录10分20时的吸光度A2，计算∆A=A1-A2。
三、PFK活力单位的计算：
1. 血清（浆）PFK活力的计算:
单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK（U/mL）=[△A×V反总÷（ε×d）×109 ] ÷V样÷T=450×△A
2. 组织、细菌或细胞中PFK活力的计算:
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK（U/mg prot）＝[△A×V反总÷（ε×d）×109 ] ÷(Cpr×V样)÷T=450×△A ÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK（U/g 鲜重）＝[△A×V反总÷（ε×d）×109 ] ÷(W×V样÷V样总)÷T=450×△A ÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和1nmolATP转化为1nmol果糖-1,6-二磷酸和1nmol ADP定义为一个酶活力单位。
PFK（U/104 cell）＝[△A×V反总÷（ε×d）×109 ] ÷(500×V样÷V样总)÷T=0.9×△A
V反总：反应体系总体积，8.4×10-4L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
注意事项：
1. 测定过程中试剂三、试剂四和样本在冰上放置，以免变性和失活。
2. 比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3. 好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以实验结果的准确性。
4. 若∆A大于0.5，需将酶液用酶提取液稀释，使∆A小于0.5，可提高检测灵敏度。
原创作者：上海尚宝生物科技有限公司
