微生物及液体样本中甲醛脱氢酶（FDH）活性检测试剂盒 （微量法）

（微量法）

产品货号：BA1911

产品规格：100T/96S

产品简介：

甲醛脱氢酶存在于绝大多数原核生物以及所有的真核生物中，是一种将甲醛进行转换的氧化还原酶。甲醛脱 氢酶催化甲醛和NAD+产生NADH，在340nm处的吸光值会增加，测定340nm处的吸光值变化，可计算得到甲醛脱氢酶的活性。

注意：实验之建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1. 试剂二：临用取1支加入0.25mL蒸馏水，震荡使其充分溶解（1瓶粉剂溶解后可做100T，为了延长使用时间，此产品多给1瓶粉剂），可分装后-20℃保存2周，避免反复冻融。

2. 试剂二工作液：临用按试剂二：蒸馏水=1:29的体积比例稀释试剂二，现用现配。

3. 试剂三：临用取1支加入0.6mL蒸馏水，震荡使其充分溶解。用不完的试剂4℃分装保存2周。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、低温离心机、恒温水浴锅/培养箱、可调式移液枪、超声波细胞破碎仪、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液， 超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔9s，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清（若上清不够澄清，建议重复上述离心步骤），置于冰上待测。

血清及液体样本：直接检测，若液体不澄清，可以离心后取上清测定。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 临用将试剂一置于37℃预热10min。

3. 在微量石英比色皿或96孔UV板中依次加入20μL样本、110μL试剂一、50μL试剂二工作液、10μL试剂三、10μL试剂四，立即充分混匀后于340nm处测定20s时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴锅或者培养箱5min（酶标仪有控温功能可将温度调至37℃），拿出迅速擦干测定5min20s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

三、酶活性计算

A、按微量石英比色皿计算

1. 细菌或培养细胞中FDH活力的计算

（1）按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每10⁴个细菌或细胞每分钟催化1nmol NAD+生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

FDH酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样÷V样总×N）÷T×F =ΔA×321.54÷N×F

（2）按蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1nmol NAD+生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

2. 血清（浆）或液体样本FDH活力的计算

（1）按液体体积计算：

单位的定义：每mL液体样本中每分钟催化1nmol NAD+生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

FDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷V样÷T×F =ΔA×321.54×F

（2）按蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化生成1nmol NAD+生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

ε：NADH摩尔消光系数，6220L/mol/cm；d：石英比色皿光径，1cm；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；V反总：酶促反应总体积，2×10^-4L；V样总：加入提取液体积，1mL；V样：加入样本体积，0.02mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；N：细胞或细菌总数，以万计；F：稀释倍数；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

B、按96孔UV板计算

将上述公式中d=1cm变为d=0.6cm，代入公式进行计算即可。

注意事项：

1. 如果测定吸光值A＞1.5或ΔA＞0.5，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低，建议增加样本量后再进行测定。

2. 试剂四有毒性，实验时请佩戴口罩手套等防护措施。

原创作者：上海尚宝生物科技有限公司