4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）活性检测试剂盒 （紫外分光光度法）

（紫外分光光度法）

注意：正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

产品货号：BA1005

产品规格：50管/48样

产品内容：

提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用加入6mL蒸馏水溶解，可以分装后-20℃保存，避免反复冻融。

试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用用6mL蒸馏水溶解备用，可以分装后-20℃保存，避免反复冻融。

试剂五：粉剂×1支，4℃保存；加入1mL蒸馏水溶解。临用用蒸馏水稀释40倍后备用，现用现配。

产品说明：

4-香豆酸：辅酶A连接酶（4-coumarate:CoA ligase，4CL）是木质素生物合成的关键酶之一，主要催化肉桂酸及其羟基或者甲氧基衍生物生成相应的辅酶A酯，这些中间产物随后进入苯丙类衍生物支路合成途径。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。

4CL催化4-香豆酸和 CoA生成4-香豆酸CoA，其在333nm 下测有特征吸收峰，测定4-香豆酸CoA的生成速率，即可反映4CL活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤：

1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至333nm，蒸馏水调零。

2、工作液的配制：按体积比将试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=1:1:1:1的比例配制工作液，现用现配。

3、操作表：在1.5mLEP管中进行下列操作：

4CL 活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。

4CL（U/mg prot）＝[∆A×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=15.87×∆A÷Cpr。

（2）按样本鲜重计算：

单位定义：每g组织每分钟生成1 nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。

4CL（U/g 鲜重）＝[∆A×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=15.87×∆A÷W。

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。

4CL（U/104 cell）＝[∆A×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.03174×∆A。

V反总：反应体系总体积，1×10^-3L；ε：4-香豆酸辅酶A摩尔消光系数，2.1×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1、若∆A大于0.5，将粗酶液用蒸馏水稀释后再进行测定。

2、建议一次测定不要测定过多样品以免耽误过多的酶促反应时间。

3、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.01。

原创作者：上海尚宝生物科技有限公司