小罗开讲 | 数字PCR之“分”而治之纳米微孔对dPCR定量结果的影响

首先需要明确纳米微孔的数量

是如何影响dPCR的定量结果。

dPCR采用直接计数的方法进行定量分析，即在PCR扩增结束后，将有荧光信号的纳米微孔记为1，无荧光信号记为0（定量是二进制的，因此称为“数字”）。有荧光信号的微孔说明至少含有一个拷贝的目标分子。在目标DNA浓度极低的情况下，理论上可以认为有荧光的纳米微孔数目就等于DNA分子的拷贝数，但通常情况下，数字PCR的纳米微孔中可能会包含两个甚至更多的目标分子，因此需要采用泊松概率分布公式来进行计算：

λ = −ln (1 − p)

λ：每个微孔的目标分子的平均数量

p：具有正信号的纳米微孔数量与微孔总数的比值。

可以使用λ计算出目标分子的绝对数量【2】，很明显，微孔数越多，检测的动态范围就越广【3】。

图1的泊松概率分布曲线图更直观地体现了这一点：

如图1显示，随着阳性微孔比例（p）的增加，体系中目标分子的平均拷贝数会有较大的差距，随着p的持续增加，dPCR结果的不确定度也随着提高。总体来说，dPCR阳性微孔数量不得超过总微孔数量的80%，总反应微孔数的增加提高的是dPCR检测的线性范围。

在传统模拟分析中，测量的不确定度通常受检测仪器分辨率的限制，例如，荧光检测器分辨荧光信号微小差异的能力。但在dPCR 检测中，检测仪器只需要识别每个纳米微孔是否有0个或大于1个目标分子，因此dPCR的数据分析较少依赖于检测器的特性。排除了检测器对dPCR定量结果的影响，那么下一个需要明确的信息是什么呢？

需要明确的是

引起dPCR偏差的来源有哪些。

dPCR主要有2个引起偏差的来源，分别是：二次采样误差和分区误差。二次采样过程引入了不可避免的误差源，尤其是当原始样本中要检测的目标很少时，设定了检测下限，仪器本身能兼容的二次采样体积越大，一定程度上能提高检测的灵敏度。

根据泊松分布原理，阳性微孔比例不超过80%，所以分区误差在原始样本浓度较高的情况下占主导地位。在一组重复实验中，若信号为0的微孔数量存在差异，该差异会引起总反应体系中目标结果计算的差异。根据 Dube 等人的分析，可以找到对分区误差的计算方式【4】【5】，根据该计算方式我们可以比较不同纳米微孔数量下的分区误差【6】。

图2比较了20,000个微孔和1,000,000个微孔的二次采样和分区误差与样本浓度的关系。在dPCR中，通常将每个纳米微孔中的模板拷贝数λ的范围调整到0.001到6【4】（在某些情况下，可以高达8【7】）。在纳米微孔N为1,000,000时，分区错误显著下降到<3%，说明微孔数量越多，越能降低分区误差，从而提高dPCR的检测准确度。

图2 . ( A ) 20,000 个分区和 ( B ) 1,000,000个微孔的

二次采样和分区误差与样本浓度的关系

（图片来源：罗氏诊断整理）

由dPCR定量的原理分析得出，“分”成的纳米微孔数量与定量结果的准确性和检测范围紧密相关，总结下来就是：微孔越多，dPCR结果越准确，动态范围越广。