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真菌DNA的提取详细操作步骤
点击次数：319 发布时间：2017/1/19 14:48:15
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吴*
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真菌DNA的提取详细操作步骤
1.真菌菌丝0.5-1g，在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min，期间混匀2-3次
3.加入1mL 5M KAc，冰浴20min
4.:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm，4℃离心5min)
5.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，静置约30 min
6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ul TE中
7.加入1ul RNaseA(10mg/mL)，37℃处理1h
8.用酚(pH8.0)::异戊醇(25:24:1)和:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm，4℃离心5min)
9.取上清，1/10V 3M NaAc，2.5V体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ul TE中，-20℃保存备用
DNA提取缓冲液：100mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，1.5M NaCl，2% CTAB(W/V)，4% PVP40(W/V)和2%巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入5M KAc
1.真菌菌丝0.5-1g，在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min，期间混匀2-3次
3.加入1mL 5M KAc，冰浴20min
4.:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm，4℃离心5min)
5.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，静置约30 min
6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ul TE中
7.加入1ul RNaseA(10mg/mL)，37℃处理1h
8.用酚(pH8.0)::异戊醇(25:24:1)和:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm，4℃离心5min)
9.取上清，1/10V 3M NaAc，2.5V体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ul TE中，-20℃保存备用
DNA提取缓冲液：100mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，1.5M NaCl，2% CTAB(W/V)，4% PVP40(W/V)和2%巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入5M KAc
原创作者：上海谷研生物科技有限公司
