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β-半乳糖苷酶试剂盒说明书
点击次数：133 发布时间：2016/10/24 8:55:04
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王**
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β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase, β-GAL）试剂盒说明书
分光光度法 50 管/24 样
测定意义：
β-GAL(EC 3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物
中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。
测定原理：
β-GAL 分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL 活性。
自备用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 5mL 双蒸水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂二：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。试剂三：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
粗酶液提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入
1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 400nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂）：
| 试剂名称（μL） | | | 测定管 | | 对照管 | |
| | | | | | | |
| 试剂一 | | 200 | | | | |
| | | | | | | |
| 蒸馏水 | | | | | | 200 |
| | | | | | | |
| 试剂二 | | 250 | | | 250 | |
| | | | | | | |
| 样本 | | 50 | | | 50 | |
| | | | | | | |
| | 迅速混匀，放入 37℃准确水浴 30min | | ||||
| | | | | | | |
| 试剂三 | | 1000 | | | 1000 | |
| | | | | | | |
充分混匀，400nm 处测定吸光值 A，计算ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。
β-GAL 活性计算：
标准条件下测定的回归方程为 y = 0.32x -0.0027；x 为标准品浓度（nmol/mL），y 为吸光值。（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL 活力(U/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.32×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=62.5×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL 活力(U /g 鲜重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.32×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=62.5×(ΔA+0.0027) ÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL 活力(U/104 cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T
=0.125×(ΔA +0.0027)
Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；V 反总：反应体系总体积，0.5mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数，500 万；T：反应时间，0.5h。
原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司
