RNA提取常见问题

A、新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。

B、新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品（如肝脏，胸腺等），即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。

C、冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。

D、外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。

E、内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。

2、OD260/280比值偏低

A、蛋白质残留

使用酚抽提，去除残留的蛋白质（但经此步骤操作，约损失40%的RNA）。

B、盐分残留

加入2.5倍体积的无水乙醇和终浓度是0.1M的NaCl沉淀RNA，-20℃放置30分钟充分沉淀RNA，然后4℃下10,000×g离心15分钟收集沉淀，溶于DEPC处理过的水中。

C、设备限制

测定OD260及OD280数值时，使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。

3、RNA提取得率低

A、使用样品过多，超过吸附柱的最大结合量

使用过多的样品，将会导致RNA的降解。

B、Wash Buffer中未加入无水乙醇

使用前，需在DNA Wash Buffer和DNAse I Stop Buffer 中加入无水乙醇。

C、洗脱不正确

加入洗脱Buffer后，放置2~3分钟在进行离心洗脱。

D、处理样品太多

减少处理样品的量。

E、样品中RNA本身含量低

增加样品用量和裂解液用量。

F、电泳检测时，换用新的电泳缓冲液，并尽量减少电泳时间。

4、基因组污染

A、RT-PCR反应中，使用过量的RNA

减少RT-PCR反应中RNA模板的量至50~100 ng。

B、使用过多的组织

使用过多的组织将会导致大量基因组DNA的污染，减少起始组织样品的量。大部分组织采用30 mg，或者更少量的组织量不会出现基因组污染。

C、增加裂解缓冲液的用量

D、对有些本身DNA含量过多的样品，可使用RNAse-Free的DNAse I处理后进行后续实验。

4、乙醇残留

洗脱前应保证乙醇去除干净，可将吸附柱开盖离心2分钟。

5、柱子堵塞

A、裂解不完全，或者匀浆不彻底

减少起始样品的量，或者增加裂解缓冲液的量，并增加裂解时间。

B、上清中含有沉淀

吸取上清时，小心操作避免吸起沉淀。

原创作者：上海酶远生物科技有限公司