微生物快速检测方法及应用进展

①常规微生物检测项目

细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、霉菌及酵母菌等

②致病微生物检测项目

沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等

二、微生物快速检测方法：

快速测试片法：快速测试片是以纸膜、纸片等作为培养基的载体，把特定的某种培养基和显色物质附着在上面，然后再通过微生物在它上面的生长，来测定微生物的方法。这种检测方法具有可测定少量的检验品，需要的器皿少，易于保存运输，操作快捷方便等优点。所以适合在实验室和生产现场等环境。其实验结果能反映出样本中细菌的真实数目，可以防止在延长接种的时间时候，由于细菌的繁殖作用，而造成数量增多。并且测试片在使用前不需要准备工作，从而大大缩短了试验时间。但该方法成本比传统方法要稍高些，而且测试细菌总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌时不能节约培养时间。

PCR技术：PCR技术，即聚合酶链式反应技术。可以在试管中直接建立微生物反应，几个小时后就能把非常小量的基因扩增至许多倍。PCR技术已有三种方法应用于微生物检测：①使用一套特异性的引物或者由一个普通引物和一个特异引物组成的一套引物，利用这种PCR技术只能产生一种产物；②用任意引物，得到DNA片段一系列的混合物，使用这种PCR方法，可以检测出一些腐败菌种以及它的亚种；③嵌套多聚酶链反应技术，在操作中需要有两套引物，第一套引物会产生扩增的DNA片段，在这个片段中包含有第二轮引物的结合位点。这样第一轮反应产物就将会被等分转入第二轮引物。PCR方法一般不需增菌太长时间，通过PCR方法对待测微生物的特征片断进行扩增，然后通过凝胶电泳或荧光PCR技术判断结果。但是该方法通量与快速测试片法和酶联免疫法相比检测通量小、检测费用高。

基因探针技术：这种技术是利用有同源性序列的核糖核酸的单链，在某种特定的条件下会形成稳定的DNA和RNA或DNA和DNA链的原理，并且采用具有高度特异性的基因片段来制备基因探针，从而识别细菌。该技术在国外已经表现的相当成熟，方法检测致病菌，特异性较强，技术较为前沿，特别是相对国标方面来说。假阳性概率仍然较高，因此只能作为一种初筛方法。

选择、鉴定用培养基法：该方法是通过在培养基里面加入具有某种特异性的荧光反应底物、生化反应底物以及酶反应底物等，使对目标培养物的选择、分离以及鉴定等工序一次性完成。这个方法操作简便，因此对操作者的要求较低，在经过短期的培训后就可以上岗，取得经济效益和社会效益都较快，因此，应用前景十分广泛。但该方法成本比快速测试片法要稍高些，且不能节约培养时间。

胶体金技术：该技术以纳米金颗粒作为标记指示物，应用“双抗夹心法”的原理，将样品中的微生物和金标记的特异性单克隆抗体结合及预包被于NC膜T线位置的特异性多克隆抗体结合，金颗粒的聚集而显示明显的红线。通过肉眼直接观察是否出现T线，判断样品中是否含有某种微生物。该技术具有方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点，因而特别适合于广大基层检验人员以及大批量检测和大面积普查等，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。但它只可定性判断，对疑似个体需采用国标方法进一步确认。

酶联免疫技术：酶联免疫技术是以抗原与抗体的特异性结合作为基础，再配合免疫放大技术，从而检测微生物的方法。使用这种方法，样品在进行增菌以后，不需要再分离，就可以对其进行筛选，并且灵敏度高，样品在经过增菌以后可以在非常短的时间内就达到检出度并且抗原和抗体结合的反应也可在很短时间便完成，目前在基层单位这种快速检测技术最为广泛的。但是该技术一般情况下仍需要增菌。

免疫磁球法：免疫磁球法是把特异性的抗体偶联于磁性的颗粒的表面，然后和样品中待检测的微生物发生某种特异性的结合。磁性微球如果载有致病微生物，就会向磁极的方向聚集。因此可以把待检测微生物从样品中快速地分离出来。采用这种方法，极大地提高了病原性的溶血性弧菌检出率，并且可以快速准确地从含有很多杂菌的悬液中分离出目的微生物。因此该方法具有便捷、快速，分离纯度高等优点，但是如何避免包覆的高分子层的分解以及磁性微球的再生，增长微球的使用寿命并实现商业化生产，是现在研究方向。

ATP生物荧光法：ATP是化学物质三磷酸腺苷，存在于所有的生物体中，ATP在细胞体内主要作用是提供能量，ATP法用于检测微生物的数量依据的原理是：细菌细胞包含相当数量的ATP，ATP可用于虫荧光素-荧光素酶发光反应，从而可以检测出ATP的含量。细菌ATP应该以自由的可溶解的状态释放出来，以便在有荧光素酶、镁、氧气存在条件下与虫荧光素发生反应产生荧光。ATP法大大缩短库存时间，减少物流压力和成本。但是ATP方法需要消耗大量的较昂贵的试剂，对仪器的清洗保养要求特别高。另外，有存在假阴性的可能。随着技术的不断发展和完善，微生物快速检测技术必将会对我们的食品、环境和疾病预防等诸多方面做出巨大的贡献。

三、微生物快速检测技术的应用进展：

随着现代科技的发展，可以预料在不远的将来，传统的微生物检测技术将逐渐被各种新型简便的微生物快速诊断技术所取代。近年来兴起的基因探针技术及全自动微生物检测系统，将从根本上改变微生物的检测方法，具有非常广阔的应用前景。目前，各国都在加速科技的发展和进步，准确、可靠、快速、经济、安全的检测水平将是微生物检测技术的发展方向，这就需要快速检测技术灵敏度和准确率都要尽可能地提高，不但能够快速高效地检测样本，还必须具有较强的实际应用价值。现在，微生物快速检测技术正在迅猛地发展，虽然这些技术依然存在一些不可忽视的问题，但其应用价值日益突出。随着技术的不断发展和完善，微生物快速检测技术必将会对我们的食品、环境和疾病预防等诸多方面做出巨大的贡献。

四、公司现有微生物产品：

①快速测试片法：

快速检测试纸片

②胶体金法：

胶体金检测卡

③PCR技术：

实时定量荧光PCR检测试剂盒

实时定量荧光PCR检测仪

④ATP生物荧光法：

手持式ATP荧光检测仪

原创作者：北京维德维康生物技术有限公司