抗原修复技术操作中还应注意的一些问题

抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术，建立在Fraenkel-conrat等人[1]一系列生物化学研究，经1991年shi等人[2]发展加热持续时间和强度是重要的影响因素之一，AR液的PH值、浓度、化学成分也是重要的影响因素之一。使用低PH值AR液必须使用阴性对照片，以防止定位不准。Shi等人强调修复缓冲液的PH值对某些抗原的修复十分重要,实验中我们也发现要获得满意结果必须选择抗原修复液的最适PH值。在常规石蜡切片做AR-IHC，采用不同浓度的Alcl3液做AR液，发现4%的Alcl3取得最理想的染色。在修复的抗原中，金属盐可影响蛋白的结构。

高温抗原修复因其机理相当复杂，对某些存在的问题很难用设计对照的方法加以解决，有些抗体在冰冻切片上呈阴性反应，但在石蜡切片用抗原修复后却能很好的显示。对某些应表达在胞浆或表达在核内的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内，例如，P185、Bcl-2、P-gp、Nm23，而有些表达在核内的抗原经过量修复会出现在胞浆内，例如P53、PcNA、Ki-67等。在使用该方法时一定小心，对结果的判断也要客观地作出分析，侯宁等人发现端粒酶逆转录酶（TRT）经过抗原修复与不经过抗原修复，其染色效果明显不同，后者的阳性率明显高于前者。操作中还应注意如下问题：

1、热处理后应注意自然冷却。

2、热处理时要防止切片干燥。

3、应根据不同的抗体选择合适的抗原修复方法。

4、一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。

5、注意形态学结构的改变(一般经高温修复后胞浆会明显的破坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象，而经酶水解的切片，其细胞浆破坏视消化时间而异，但核破坏较轻)。

6、如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，或经修复后抗原定位发生改变，可改用一些不常用的缓冲液，或加一些螯合剂，如EDTA等可改善某些抗原的修复。

用于IHC消化的酶很多，所选酶的种类，使用的浓度，PH值，消化时间及温度等均要视组织固定的不同，所检测抗原的性质、组织类型的不同而异，应通过预实验摸索确定。使用酶消化的原则：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于细胞内抗原，如Keratin，CEA，GFAP等。胃蛋白酶则主要用于细胞间质抗原的检测，如fibronectin，Laminin，各型胶原等。一般来言，消化时间和组织固定的长短呈正比。在用酶消化，热修复后均不能获得结果的前提下使用抗原修复与酶消化结合的方法，有时会取得较为满意的结果。一般蛋白酶K和微波相结合，但应注意，可能检测的抗原无论何种性质均会在核内出现假阳性反应。