DpnI处理及回收

当模板质粒是从大肠杆菌提取的已甲基化的质粒，可采用Dpn I酶切方法清除模板（DpnI特异切割甲基化过的序列，细菌来源的质粒会被切碎），最后产物中无模板中的完整质粒，让后面转化过程中的阴性背景降至最低。

NEB buffer 4 5μl

NEB的Dpn I 1μl

PCR产物 45μl

37度温育2小时。

2．PCR产物回收（所有步骤均在室温下进行）

A．将PCR产物转入1.5ml 离心管中，加入4-5倍体积的Buffer CP(如果PCR产物片段小于200bp，应该加6倍体积的Buffer CP)。

B．斡旋混匀，短暂离心将溶液从管盖及壁上离心下来。

C．取HiBind DNA柱子放入2ml收集管中。

D．将混匀的样品加入柱子中，10000g离心1分钟，去掉收集管中的溶液（由于柱子一次只能容纳700μl溶液，如果溶液大于700μl，可以在这一步分两次离心）。

E．加700μl DNA Wash Buffer（使用前确认该溶液已按比例用酒精稀释过，如果冬天进行实验，DNA Wash Buffer可能因温度过低有沉积，需升温溶解上下颠倒混匀后才可使用），10000g 离心1 分钟。

F．去掉收集管中的溶液，重复步骤5。

G．去掉收集管中的溶液，13000g离心2分钟（离心完后确认Hibind Miniprep column侧壁底部有无溶液，如有，应该用细长滤纸或10ul枪头吸干净后再离心一次）。

H．将柱子放入干净的离心管中，加入30-50μl Elution buffer或双蒸水（如果长期保存，建议加入Elution buffer），静置2分钟，13000g离心1分钟收集质粒。

I．琼脂糖电泳检测或通过测A260来估算浓度： 质粒DNA= A260X50X(稀释倍数)ug/ml。

3．胶回收（所有步骤均在室温下进行）

琼脂糖电泳PCR产物，由于需要切胶回收PCR产物，所以要用新的电泳缓冲液。

A．长波长紫外线下观察DNA，并用干净刀片切下条带。不要将胶长时间暴露于紫外光下，以免在DNA上产生缺刻或双链缺口，尽量不切多余的不含目的条带的胶。

B．将切下来的胶放入干净的1.5ml 离心管中称重，按每ml胶重1g算出胶融化后的体积（即，如果重0.3g，那么溶解后为0.3ml），加入等体积的Binding Buffer，55-60℃ 孵育7min左右直至胶完全溶解，上下颠倒混匀。

C．取一个HiBind DNA柱子放入2ml收集管中。

D．将溶化后的凝胶与binding buffer混合液加入到柱子中（柱子的容量为700μl，如果体积大于700μl可分几次离心，但每个柱子的载量仅为25μg DNA，如果预期产量不止25μg DNA，可根据载量分装到几个柱子中回收），10000g离心1分钟，倒掉收集管中的溶液。

E．再加300ul Binding Buffer到柱子中，10000g离心1分钟，倒掉收集管中的溶液。

F．在柱子中加入700μl SPW Wash Buffer（使用前确认该溶液已按比例用酒精稀释过，如果冬天进行实验，SPW可能因温度过低有沉积，需升温溶解上下颠倒混匀后才可使用），倒掉收集管中的溶液。

G．重复步骤7.

H．13000g离心2分钟（离心完后确认Hibind Miniprep column侧壁底部有无溶液，如有，应该用细长滤纸或10ul枪头吸干净后再离心一次）。

I．将柱子放入干净的离心管中，加入30-50μl Elution buffer或双蒸水（加入时应该加在滤膜中央，但又要避免枪头碰到滤膜，以免戳穿。另，如果长期保存，建议加入Elution buffer），静置2分钟，13000g离心1分钟收集PCR回收产物。

J．琼脂糖电泳检测或通过测A260来估算浓度： 质粒DNA= A260X50X(稀释倍数)ug/ml。

原创作者：武汉博欧特生物科技有限公司