酵母剪接体分析实验材料

一、材料与设备

1. 从鼠组织中制备竞争性 RNA

除非另有说明，所有溶液都用无菌蒸馏水配制。

(1) DEPC 处埋水。

(2) Tris HCI 溶液：1 mol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，0.1 mol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )。1 mol/L Tris-HCl 配好后，高压灭菌，室温保存，0.1 mol/L 的 Tris-HCl 由 1 mol/L Tris-HCl 溶液加无菌水稀释而成。

(3) 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0)。

(4) 1X TE：10 mmol/L Tris-HCI ( pH 7.6 )，1 mmoI/L EDTA。

(5) 1 mol/L MgCl2 及 0.1 mol/L MgCl2 配好后灭菌，保存于室温，0.1 mol/L MgCl2 分成 500~1000 μl 每份，于 -20℃ 保存。

(6) 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.4)。

(7) 10% （m/V）SDS。

(8) 用于制备竞争性 RNA 的匀浆缓冲液：3 mol/L LiCl，6 mol/L 尿素，20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），10 mmol/L MgCl2。500 ml 的缓冲液可供从 16 只老鼠的组织中提取用 RNA 。用 DEPC 处理水配制，不能高压灭菌，制备后 24 内使用。4°C 保存。

(9) 用于制备竞争性 RNA 的溶解缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，1 mmol/L EDTA，1%（m/V）SDS。无菌条件下，室温可保存几天。

(10) 1 mol/L Tris 碱，灭菌后室温保存。

(11) Tris/EDTA 平衡苯酚，4℃ 可保存 1~2 天。长期储存应于 -20℃。当有机相变成淡橙色时应弃用。

(12) : 异戊醇（24 : 1)，磨口瓶中于室温保存。

(13) 7.5 mol/L 乙酸铵，配制好后，用 0.2 μm 孔径的滤器过滤除菌，4°C 保存。

(14) 70% 乙醇，室温保存。

2. 剪接体分析用溶液

(1) 硅烷化溶液：溶于中的 15% 二氯二甲硅烷，用带磨口塞的玻璃瓶在通风橱中保存。

(2) 1 mol/L 乙酸镁，配好后用 0.2 μm 孔径的滤器过滤除菌，于 4°C 保存。

(3) 17 X TP8 缓冲液，即 850 mmol/L Tris-磷酸，将 108 g Tris 碱和 20.0 ml 85% 磷酸 (分析纯）加入 800 ml 无菌水中，然后加水至 1 L。在 0℃ 的 pH 应该为 8.0，灭菌后 4℃ 保存。

(4) TPM8 缓冲液：50 mmol/L Tris-磷酸，在 0℃ pH 为 8.0，1.5 mmol/L 乙酸镁。

(5) 20% ( m/V ) 丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲双叉丙烯酰胺）50：1：用一次性 0.2 μm 孔径的滤器过滤，在无菌、带螺盖的瓶中于 4℃ 可保存 1 年。

(6) 10% 过硫酸铵（APS）和 TEMED。

(7) 酵母完整细胞剪接提取物。

(8) 放射性标记的前体 mRNA：放射性标记的肌动蛋白前体 mRNA 可以在体外以克隆的肌动蛋白 DNA 并经 HpaⅡ 内切酶消化的产物为模板转录得到。肌动蛋白前体 mRNA 有 92 nt 的外显子 1309 nt 的内含子和 48 nt 的外显子 2。以 40000~80000 cpm/μl 溶于水中，-20℃ 保存。

(9) 磷酸钾缓冲液 pH 7.6：为制备 1 mol/L 的磷酸钾储存缓冲液，将 8.85 g KH2PO4 和 75.8 g K2HPO4 溶于 400 ml 水中，调整其 pH 为 7.6，然后加水补充至 500 ml，灭菌后室温保存。0.1 mol/L 的磷酸钾缓冲液由 1 mol/L 的磷酸钾稀释 10 倍而成，分成 500~1000 μl 每份，-20℃ 保存。

(10) 100 mmol/L ATP：500 mg ATP 溶于 5 ml 水中，先用 5 mol/L 再用 1 mol/L 的 NaOH 把 pH 小心的调至 6.8~7.2。100 mmol/L 的 ATP 由母液用无菌水稀释而成，分成 200~500 μl 每份，于 -20℃ 保存。用前于 37℃ 水浴迅速融化，置冰上使用。

(11) 30% ( m/V ) PEG8000：称取 30 g PEG8000 加入 65~70 ml 温水（50℃ ) 中，若需要，边加热边搅拌使其溶解。溶液冷却后，加水补充至 100 ml，灭菌。分成 1 ml 或 10 ml 每份，-20℃ 保存。

(12) 1 mol/L HEPES-KOH（pH 7.4）：用 0.2 μm 孔径的滤器过滤除菌，于 -20℃ 保存。

(13) R 缓冲液：50 mmol/L HEPES-KOH ( pH 7.4 )，2 mmol/L 乙酸镁。1 ml 每份于 -20℃ 或 -70℃ 保存。

(14) 含竞争性 RNA 的 R 缓冲液：对于 7.5 μl 的剪接反应，应有 7.5 μl R 缓冲液和 15 μg 竞争性 RNA ( 溶于 0.5~1 μl )。在剪接体分析前混合 R 缓冲液和竞争性 RNA。

(15) 染料液：10%（m/V）溴酚蓝和二甲苯蓝。

(16) 上样缓冲液：217 mmol/L Tris-磷酸，0°C 时 pH 8.0，40% ( V/V ) 甘油，各 0.25% ( m/V ) 的溴酚蓝和二甲苯蓝，加 2.5 ml 17X TP8 缓冲液、2.5 ml 灭菌的甘油和 250 μl 染液到 4.75 ml 水中。分成 1 ml 每份，-20℃ 保存。

(17) 15% ( V/V ) 甲醇，5%（V/V）乙酸。螺口瓶中于室温保存。

3. 内源性 snRNP Northern 杂交分析用溶液

(1) 10X TBE：890 mmol/L Tris-硼酸，25 mmol/L EDTA ( pH 8.3 )。室温保存。

(2) 1 XTBE，8 mol/L 尿素：89 mmol/L Tris-硼酸（pH 8.3)，2.5 mmol/L EDTA，8 mol/L 尿素。

(3) 0.25XTBE：由 10XTBE 用去离水稀释而成。

(4) 20X SSCP：2.4 mol/L NaCl，0.3 mol/L 柠檬酸钠，0.40 mol/L 磷酸钠（pH 7.0)。室温存放。

(5) 去离子甲酰胺。

(6) 50X Denhardt 溶液：1%（m/V）水溶性聚庶搪 ( Ficoll，平均分子质量为 400000 Da )，1% ( m/V ) 聚乙烯吡咯烷酮（平均分子质量为 40000Da)，1% ( m/V）BSA。用 0.45 μm 孔径的一次性滤器过滤后分成 20~50 ml 每份，于 -20℃ 保存。

(7) 单链鲑鱼精 DNA (ssDNA )，10 mg/ml：在 1XTE 中溶解双链鲑鱼精 DNA 50 μg/μl。超声处理以剪切 DNA，使之断裂为 300 bp 的片段（用琼脂糖凝胶电泳分析）。煮沸迅速冷却，然后用 TE 稀释到 10 μg/μl，分装后于 -20°C 保存。

(8) Northern 印迹杂交液：50% ( m/V）甲酰胺，0.1%（m/V）SDS，5X SSCP，3X Denhardt 溶液，100 μg/ml ssDNA。-20℃ 保存，用前加热到 60~65°C。

(9) 50 mmol/L EDTA（pH 8.0)，0.1 % ( m/V ) SDS。

(10) 放射性标记的探针：在本实验中，用 snRNA 基因的双链 DNA 片段来制备 Northern 杂交用探针。该 DNA 片段可以从克隆的 DNA 用内切酶消化并用琼脂糖凝胶电泳纯化而得来，也可以用 PCR 扩增的方法制备。snRNA 基因的 DNA 片段长度范围为 200~1300 bp。DNA 片段经随机 6 聚脱氧寡核苷酸引物反应被放射性标记，用 Klenow 聚合酶和放射性核苷酸（2.5 μl [ α-32P ] dATP，为 3000 Ci/mmol，10 mCi/ml )，25 μl 反应体系。加入 225 μl 50 mmol/L EDTA，0.1% SDS 终止反应。探针在 100°C 加热 10 min 变性后立即加入到 15 ml 65°C 的杂交液中。

(11) 3X Northern 印迹洗涤缓冲液：3X SSCP，0.1% SDS。

(12) 0.1X Norhern 印迹洗涤缓冲液： 0.1X SSCP，0.1% SDS。

4. 设备

(1) 液氮 （N2）。

(2) 离心机，匀浆器，旋转真空浓缩仪。

(3) 各种试管、离心管。

(4) 玻璃板：一块为 26.5 cm 高、20.2 cm 宽、0.4 cm 厚。带凹口的玻璃板尺寸同前一块，但带一 2.2 cm 深、16.3 cm 宽的凹口。

(5) 聚四氟乙烯垫片和梳子：垫片和梳子厚度为 0.5 mm，梳子宽为 16 cm，高 2.7 cm，14 个齿，齿宽 8 mm，长 11 mm，齿间间隔为 3 mm。

(6) 黄色胶带。

(7) 电泳槽。

(8) 电源：能提供 200 V 电压和 50 mA 电流的电源，恒压。

(9) 微型脉冲蠕动泵或同类产品。

(10) 平头毛细管吸头。

(11) Whatman 3 MM 滤纸。

(12) 硬质玻璃盘或不锈钢盘（浸泡凝胶和洗 Nonhern 印迹用）：先用肥皂和水洗涤， 在 252℃ 干烤 4~5 h。然后用去离子水漂洗，空气干燥。

(13) 电转移装置：可同时放两块凝胶，该装置放在冷室中。

(14) 紫外交联仪：三个 15 W 的紫外灯管相互间隔 8.5 cm，离样品平面 35 cm。

(15) 微波炉或加热盘 ( hot plate)。

(16) 杂交袋和密封器。

(17) 水浴振荡器或杂交炉。

(18) X 射线片，压片暗盒，增感屏和胶片处理设备。

(19) 凝胶干燥器（可选）。