HPLC法测定中淫羊藿苷含量

本实验旨在对淫羊藿CO 超临界流体萃取物 的研究中，建立准确，快速，灵敏的质量控制方法， 以期更有效的开发利用这一天然药物资源。

1 仪器与试药

1．1 仪器

DOINEX高效液相色谱仪(配有PDA一3000光电 二极管矩阵检测器，P一3400A分析泵)，Chromeleon 色谱工作站；HA221—50—06型超临界萃取装置(江 苏南通华安公司)；FA1004N型电子分析天平(上海 精密科学仪器有限有限公司)；KQ一100型超声波清 洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1．2 试药

淫羊藿苷对照品自中国药品生物制品检定所 购买；淫羊藿叶购自河南聚仁中药饮片有限公司， 批号20091115；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其它试 剂均为分析纯；二氧化碳(99．95％)。

2 方法与结果

2．1 淫羊藿超临界提取物的薄层色谱鉴别

2．1．1 供试品溶液的制备

取淫羊藿药材粉末100 g装于萃取釜，以cO：为 溶剂，设定萃取釜、解析釜的温度分别为60℃、25℃， 压力分别为30 MPa、6 MPa，进行动态萃取2 h，得到 萃取物，制得供试品溶液备用。

2．1．2 淫羊藿苷对照品溶液I的制备 精密称取淫羊藿苷对照品10．0 mg于10 mL量 瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，得1．0 mg·mL 的 对照品溶液I。

2．1．3 薄层鉴别

分别吸取上述供试品溶液、对照品溶液I，硅胶 H板上点样，以一甲醇一甲酸为展开剂，1％三氯 化铝乙醇溶液显色，置紫外灯365 nm下检视，供试 品溶液在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色 的斑点，说明样品中含有淫羊藿苷成分。

2．2 淫羊藿超临界提取物的高效液相色谱检测

2．2．1 色谱条件

本文参照有关文献嘲，制定如下色谱条件，色谱 柱：Hypersil ODS C18柱(250 mm~4．6 mm，5 m)，流动 相：流动相A(甲醇)和B(0．1％冰醋酸溶液)梯度洗脱 0 min，A 30％ ，B 70％ ；10 min，A 55％ ，B 45％ ；15 min，A 67％ ，B 33％ ；20 min，A 68％ ，B 32％ ；22 rain，A 75％ ， B 25％。流速：1 mL·min ；检测波长：270 lqm；柱温： 25 oC；进样量：20 IxL，色谱图见图1。

2．2．2 色谱系统适用性实验

按淫羊藿苷峰计算，色谱系统的理论塔板数为 48 784；淫羊藿苷与其相邻的色谱峰的分离度大于 1．5，淫羊藿苷与相邻的色谱峰可以完全分离。 2．2．3 淫羊藿苷对照品储备液Ⅱ的制备 精密称取淫羊藿苷对照品10．6mg，置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为 1．06 mg·mL 的对照品储备液Ⅱ。

2．2．4 线性关系考察

精密吸取对照品储备液Ⅱ0．1，0．2，0．4，0．6，0．8， 1．0 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。 按色谱条件测定，以峰面积为纵坐标、进样量为横坐 标绘制标准曲线，得到线性回归方程：Y=48．838X+ 3．467 8，r=0．999 1。结果：淫羊藿苷在0．212—2．12 Ixg 进样量范围内线性关系良好。

2．2．5 样品稳定性实验

样品溶液室温放置，于8 h内每间隔2 h测定淫 羊藿苷的含量，RSD为0．99％，说明样品溶液在8 h 内基本稳定。

2．2．6 精密度实验

按色谱条件测定，对0．010 6、0．063 6、0．106 mg·mL 3个质量浓度分别进样3针，量取峰面 积，计算RSD。高、中、低3个质量浓度的RSD分 别为1．17％、1．92％、1．59％。由实验结果可知，测定 方法的RSD值不大于1．92％。

2．2．7 重复性实验

取同一批淫羊藿药材，按“2．1．1”项下方法，平行制 备6份供试品溶液，分别测定含量。淫羊藿苷含量测定 结果的RSD为2．22％，表明分析方法重复性良好。

2．2．8 加样回收率实验

精密称取同一批号已知含量的样品6份，分别 按其中淫羊藿苷含量的80％、100％、120％~人淫羊 藿苷对照品，按样品溶液的制备方法操作，分别进 样，计算回收率。平均加样回收率为98．7％，RSD为 1．18％(n=6)。

2．3 淫羊藿超临界萃取物的测定

分别按上述确定的方法制备样品后测定淫羊藿苷的含量，3次测定结果得到淫羊藿苷在药材中 的平均含量为0．092 mg／g。

3 结论

3．1 比较图b和图c可以看出，超临界流体萃取的 选择性较好，萃取物的淫羊藿苷含量较高，杂质成 分相对较少，有利于粗提物的进一步精制。索氏提 取样品的杂质相对较多，而且需要耗费更多的有机 溶剂和提取时间。超临界萃取技术可以应用于淫羊 藿中淫羊藿苷的提取。

3．2 实验先后选择甲醇一0．5％冰醋酸(60：40)、甲 醇一0．1％冰醋酸(60：40)，甲醇一0．1％冰醋酸(梯度洗 脱)体系，从分离情况和出峰时间等综合分析，选择 了甲醇一0．1％冰醋酸梯度洗脱，色谱条件稳定。

3-3 超临界CO：萃取技术在中药提取中具有绿色 环保等诸多优点，本实验针对该技术提取的淫羊藿 超临界CO：萃取物，建立了高效液相色谱分析方 法，具有较高的精密度，适用于检测淫羊藿超临界 提取物中淫羊藿苷的含量，同时也为黄酮类成分的 超临界萃取物质量控制提供参考。