高效液相色谱法测定染料木素浓度

染料木素(genistein)属于异黄酮类化合物，其化学名为4， 5，7一三羟基异黄酮，是一种典型的植物雌激素“J。近年来其 对中老年慢性疾病的防治作用越来越受到重视，动物实验、临 床研究以及流行病学调查表明染料木素能降低乳腺癌、前列 腺癌等疾病的发病率，缓解更年期综合征和骨质疏松症，调节 血脂、预防，~111管疾病 J。目前生物样本及食品中染料木素 的测定方法包括高效液相色谱法(I~LC) j、紫外可见分光光 度法(U-V)“』、毛细管电泳法(CE)[51、薄层扫描法 』、液质联用 法(Lc—Ms) 】、时间分辨荧光免疫分析法(17／一F1JA)‘引等，一 般多以高效液相色谱法为主，但多使用二极管阵列检测器‘9】。 本研究用紫外检测器对其进行检测，建立大鼠血清染料木素 浓度的检测方法。

l 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 实验材料：SPF级健康成年sD雄性大鼠8O只(体重 180—200g)，由中国科学院上海实验动物中心提供，实验动物 许可证：SCXK(沪)2OO7～0005。实验期间大鼠喂食无大豆饲 料，饲料组成：小麦粉20％，玉米粉32％ ，麸皮25％ ，鱼粉(进 口)15％，酵母1％，骨粉1．7％，食盐1％，鱼肝油I％，奶粉 2％，矿物质添加剂0．3％ ，维生素添加剂1％。饲养条件：中南 大学湘雅实验动物学部屏障环境动物实验室，实验动物使用 许可证号： (湘)2005—0005。

t．1．2 试剂：染料木素(含量99．3％，批号：06070617)；泮托拉唑钠(含量95．1％，批号：100575～200301，中 国药品生物制品检定所)；乙腈、甲醇、叔丁基甲醚、二甲基亚 砜(进口色谱纯，美国TED／A公司)；磷酸为国产分析纯；水为 重蒸馏水。大豆异黄酮，由山东三维长润生物有限公司提供， 规格40％，其主要成分的含量分别为：染料木苷32．0％、染料 木素0．6％、大豆苷6．2％、大豆黄素0．2％、黄豆苷0．3％、黄 豆素苷元0．2％，批号：Y07一o7Cr7。丙酸睾酮注射液，上海通 用药业股份有限公司。

1．1．3 仪器：高效液相色谱系统(岛津1_12—20A液相色谱仪， CBM一20Allte系统控制器，LC一20AT输液泵，CTO一20A柱温 箱，SIL一20A自动进样器，SPD检测器，I_E so]ution 212作站；日 本岛津公司)。SartlJUS电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限 公司)，Centrifuge 5415R冷冻变速离心机，LOZ522低速自动平 衡离心机(北京医用离心机厂)，XW280A涡旋混合器(上海医 科大学仪器厂)。

1．2 方法

1，2．1 色谱条件：色谱柱：岛津VP—ODS C18柱(250m,n x 4．6nwa，5pro，Thermo)；流动相：乙腈一0．02mol／L磷酸二氢钾(35 ：65，磷酸调pH 4．3)；流速：1．Omldmin；检测波长：26Ohm；柱温： 4o℃；进样量：lOt,L；灵敏度：0．O1AUFS。

1．2．2 标准液的配制：Z精密称取干燥过的染料木素标准品 4．3rag置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容稀释至刻度，混 匀，即得0．172mg／mL标准储备液，放置冰箱中保存。

】．2．3 内标液的配制：精密称取干燥至恒重的泮托拉唑钠 5mg置于25znL容量瓶中，用二甲基亚砜溶液溶解并定容，得0．2m#mL的内标溶液，4~C保存。

1．2．4 血样处理与测定方法：取10o 大鼠血清样品，加入 10 内标(0．2mg／mL的泮托拉唑钠)， 昆匀，加入1．5mL叔丁 基甲醚，在涡旋振荡器上混匀萃取3min，离心(3 O00dmin， 5rain)。取出上层萃取液置另一试管中，50~C水浴，N2吹干，残 渣用lOOt~L甲醇溶液混匀至充分溶解，取2 L进样分析，记录 色谱图。以样品峰面积As与内标峰面积 之比Y代入标准 曲线计算血清浓度，色谱结果见图1。

1．3 统计分析：实验结果采用SPSS16．0统计软件包建立数据 库，进行描述性统计分析和绘制统计图。

2 结果与分析

2．1 方法特异性考察

分别取空白血清、空白血清加染料木素和内标及大鼠血 清样品加入内标的样品。从标准及样品色谱图上可知，染料 木素和内标色谱峰分离良好，元杂质峰干扰，保留时间分别为 7．9rain和9．0 min。色谱结果见图1。

2．2 标准曲线的绘制

取loo止空白大鼠血清置于lOmL的具塞玻璃试管中，分 别加入不同浓度的染料木素标准贮备液1O ，混匀，使其浓度 分别为0．0098、0．O195、0．0781、0．3125、1．25、5、lO~g／mL。按血 样处理与测定方法操作，以不同浓度染料木素系列溶液的峰 面积(As)和内标峰面积( )来计算Y(Y= )，以Y为纵坐 标，染料木素的浓度x为横坐标进行线性回归。得回归曲线为：Y=0．4396X—O．0022，r=0．9998(n=7)。结果表明染料木 素在0．O1—10．00 ·llL范围内呈良好的线性关系。见图2

取标准储备液适量，各加血清0．1mL，制成含染料木素为 0和0．0]~gJnm的样品，按血样处理与测定方法操作，取20／~L 进样，用信噪比法，得染料木素的最低检测浓度为0．01~ mL。

2．4 相对回收率试验

分别于0．2mL空白大鼠血清中加入低、中、高三种浓度的 染料木素标准液20 ，混匀，使其浓度分别为0．0195、0．3125、 5．0 nlL，按血样处理与测定方法操作，以标准曲线计算出染 料木素血清浓度，以测得值与加入值之比计算回收率，每种浓 度样品重复测定5次。结果见表1。

2．5 精密度测定

取0．0195、0．3125、5．0 n】L的低、中、高三种浓度，按血 样处理与测定方法操作，以ld内每种浓度每个样品重复5次 测得的染料木素浓度计算日内精密度，分别为1．37％、 1．08％、0．89％ ；以1w内连续3d测得的染料木素浓度计算日 间精密度，分别为2．53％ 、1．98％、2．28％。

2．6 染料木素的室温稳定性

用空白血清配制0．0195、0．3125、5．0mg／L的低、中、高三个 不同浓度的样品，于室温分别放置2h、4h、8h、12h，进行稳定性 考察。测定结果显示，血清中染料木素在室温下放置12 h具 有良好的稳定性，三个浓度的tlSD值分别为2．16％、2．18％、 2．52％ 。

2．7 样品测定

8o只大鼠按体重随机分为5组：A组为正常对照组，B组 为模型组，C、D、E分别为低、中、高剂量组。除正常对照组外， 其余4组大鼠腹部皮下注射丙酸睾酮3mg·kg～ ·d一，正常对 照组注射麻油。连续注射1w后，低、中、高剂量组分别按大豆 异黄酮60mg·kg～ ·d～、120rag· ～ ·d～、240rag· ·d 灌 胃，正常对照组和模型组灌胃0．5％CMC—Na，连续28d。第 28d开始灌胃后2h尾静脉取血，离心分离血清。取0．2mL血 样按血样处理与测定方法操作，以标准曲线计算出染料木素 血清浓度，结果见表2。血清染料木素浓度E组>D组>C 组。

3 讨论

大鼠血清中染料木素浓度低，干扰物质较多，给直接测定 带来很大的不便，一般多采用有机溶剂萃取后进行测定。本 实验中选择叔丁基甲醚不仅可以有效地提取样本中的染料木 素，而且其干扰峰很少。在测定染料木素的Ⅲ，IC方法中使用的流动相往往都含有大量的水及一定的酸，易造成染料木素 水解，因此选择岛津VP—ODS C18色谱柱作为检测柱，在长期 的检测过程中体现了良好的重现性及稳定性。传统方法中流 动相为甲醇一醋酸铵体系或甲醇一水体系，前者易造成仪器 内部堵塞、损伤色谱柱，后者则易出现色谱峰出峰过快或峰形 不好，经过试验摸索，本方法选择采用乙腈一0．02mol／L磷酸二 氢钾缓冲液(35：65，pH 4．3)作为流动相，可避免前述方法的诸 多缺点，节省试剂及试验时间，延长色谱柱的使用寿命。

为研究不同剂量大豆异黄酮对良性前列腺增生雄性大鼠 的影响，根据文献 。 报道SD大鼠摄入染料木素2h后血清水 平达到峰值，对这一时点大鼠血清染料木素测定的结果显示， 本实验方法简便、快速、灵敏，重现性及稳定性较好，无需使用 较为昂贵的质谱仪，广泛适用于大鼠血清染料木素浓度测定 和药代动力学的研究 。