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经典收藏：BIM试剂盒实验的六大阶段
点击次数：654 发布时间：2016/10/25 9:08:34
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钱**
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上海沪鼎是国内最优秀的领先elisa试剂盒研发、代理商之一。我司自代理BIM品牌试剂盒以来，收到了广大科研爱好的青睐。为此我司技术人员特别分析整理出了BIM试剂盒实验的六大阶段，供各位老师和同学观摩！
第一阶段：捕获抗体包板；
1.将捕获抗体稍作离心，使抗体集中于管底；
2.用无菌水将捕获抗体重悬至说明书上要求的浓度，静置10分钟以使抗体完全溶解；
3.重悬的抗体以最高速度离心3分钟；
4.用1xPBS稀释捕获抗体至说明书上要求的浓度；
5.轻轻颠倒或振荡混匀，一定不要产生气泡；
6.立即在每个ELISA板孔中加入100uL捕获抗体；
7.将封板膜用力压盖在ELISA板上，注意不要使抗体滴溅在封板膜上；
8.25℃孵育过夜，或者37℃孵育2-4个小时；
9.洗板时需将液体倒掉，并在干净的吸水纸上拍干；
10.每孔加入300ul 洗液，然后再将液体吸除；
11.该步骤再重复3次，总共洗涤4次；
12.最后一次洗涤后，将板倒置以去除液体，并在干净的吸水纸上拍干；
13.ELISA板还有其它几种洗涤方法；
14.无论使用哪种方法，请在整个ELISA实验过程中保持一致。
第二阶段：封闭非特异性结合
1.牛血清白蛋白作为封闭试剂，可封闭塑料孔内任何未结合蛋白的位点；
2.每孔中加入300ul封闭液；
3.封板，并在25 ℃孵育至少1小时。
第三阶段：抗原的特异性结合
1.在上一孵育过程结束前；
2.将标准品稍作离心；
3.并用无菌水重悬至要求的浓度；
4.静置至少10分钟，以使标准品完全溶解；
5.重悬结束后，取出板并洗涤4次；
6.重悬的标准品以最高速度离心3分钟；
7.稀释到所需浓度，轻轻颠倒或振荡混匀；
8.标准曲线在ELISA板上的区域专用于检测已知浓度的蛋白标准品；
9.如果使用多道移液器，除第一列外的所有标准曲线孔中均加入100ul稀释液；
10.然后，在标准曲线孔的第一列中加入200ul标准品溶液；
11.依次倍比稀释，标准品至少有6个浓度；
12.每个标准曲线孔中液体的终体积应为100ul；
13.标准品至少有6个浓度，每个浓度为3个复孔，再设6个空白孔，其中仅含稀释液；
14.空白孔是必须的，它们将用来评价试剂盒检测样本的效能；
15.然后，在剩余孔中加入待测样本，每个样本设3个复孔；
16.样本中若待检抗原的浓度过高，要得到最佳结果可能需对样本进行稀释。
17.封板，25℃孵育2小时
第四阶段：加入生物素标记的检测抗体以形成夹心
1.孵育结束前，稍离心检测抗体，并用无菌水重悬，静置10分钟；
2.孵育结束后，取出板，洗涤4次；
3.最高速度离心3分钟；
4.用稀释液将检测抗体稀释至要求的浓度；
5.轻轻混匀，立即在每孔中加入100ul检测抗体液；
6.封板，25℃孵育2小时。
第五阶段：夹心上加酶联亲合素
1.板在孵育过时，从冰箱中取出一管Avindin-HRP(6ul)，使其融化；
2.板孵育结束后，洗涤4次；
3.用稀释液1:2000稀释Avidin-HRP；
4.轻轻混匀，立即向每孔中加入100ul；
5.封板，25℃孵育30分钟；
6.为降低背景干扰，请确保孵育时间正好为30分钟。
第六阶段：底物显色
1.孵育结束后，立即洗板。每孔加入100ul ABTS底物溶液；
2.Avidin-HRP仅可与ABTS配合使用；
3.如与TMB或其它底物溶液配合使用，会显著提高背景显色；
4.室温孵育显色；
5.每隔5分钟读板一次，最长可监测60分钟；
6.在酶标仪上设置合适的校正波长；
7.EDK不同，以及说明书上所要求的读板时间不同均可能导致OD值的差异。
第一阶段：捕获抗体包板；
1.将捕获抗体稍作离心，使抗体集中于管底；
2.用无菌水将捕获抗体重悬至说明书上要求的浓度，静置10分钟以使抗体完全溶解；
3.重悬的抗体以最高速度离心3分钟；
4.用1xPBS稀释捕获抗体至说明书上要求的浓度；
5.轻轻颠倒或振荡混匀，一定不要产生气泡；
6.立即在每个ELISA板孔中加入100uL捕获抗体；
7.将封板膜用力压盖在ELISA板上，注意不要使抗体滴溅在封板膜上；
8.25℃孵育过夜，或者37℃孵育2-4个小时；
9.洗板时需将液体倒掉，并在干净的吸水纸上拍干；
10.每孔加入300ul 洗液，然后再将液体吸除；
11.该步骤再重复3次，总共洗涤4次；
12.最后一次洗涤后，将板倒置以去除液体，并在干净的吸水纸上拍干；
13.ELISA板还有其它几种洗涤方法；
14.无论使用哪种方法，请在整个ELISA实验过程中保持一致。
第二阶段：封闭非特异性结合
1.牛血清白蛋白作为封闭试剂，可封闭塑料孔内任何未结合蛋白的位点；
2.每孔中加入300ul封闭液；
3.封板，并在25 ℃孵育至少1小时。
第三阶段：抗原的特异性结合
1.在上一孵育过程结束前；
2.将标准品稍作离心；
3.并用无菌水重悬至要求的浓度；
4.静置至少10分钟，以使标准品完全溶解；
5.重悬结束后，取出板并洗涤4次；
6.重悬的标准品以最高速度离心3分钟；
7.稀释到所需浓度，轻轻颠倒或振荡混匀；
8.标准曲线在ELISA板上的区域专用于检测已知浓度的蛋白标准品；
9.如果使用多道移液器，除第一列外的所有标准曲线孔中均加入100ul稀释液；
10.然后，在标准曲线孔的第一列中加入200ul标准品溶液；
11.依次倍比稀释，标准品至少有6个浓度；
12.每个标准曲线孔中液体的终体积应为100ul；
13.标准品至少有6个浓度，每个浓度为3个复孔，再设6个空白孔，其中仅含稀释液；
14.空白孔是必须的，它们将用来评价试剂盒检测样本的效能；
15.然后，在剩余孔中加入待测样本，每个样本设3个复孔；
16.样本中若待检抗原的浓度过高，要得到最佳结果可能需对样本进行稀释。
17.封板，25℃孵育2小时
第四阶段：加入生物素标记的检测抗体以形成夹心
1.孵育结束前，稍离心检测抗体，并用无菌水重悬，静置10分钟；
2.孵育结束后，取出板，洗涤4次；
3.最高速度离心3分钟；
4.用稀释液将检测抗体稀释至要求的浓度；
5.轻轻混匀，立即在每孔中加入100ul检测抗体液；
6.封板，25℃孵育2小时。
第五阶段：夹心上加酶联亲合素
1.板在孵育过时，从冰箱中取出一管Avindin-HRP(6ul)，使其融化；
2.板孵育结束后，洗涤4次；
3.用稀释液1:2000稀释Avidin-HRP；
4.轻轻混匀，立即向每孔中加入100ul；
5.封板，25℃孵育30分钟；
6.为降低背景干扰，请确保孵育时间正好为30分钟。
第六阶段：底物显色
1.孵育结束后，立即洗板。每孔加入100ul ABTS底物溶液；
2.Avidin-HRP仅可与ABTS配合使用；
3.如与TMB或其它底物溶液配合使用，会显著提高背景显色；
4.室温孵育显色；
5.每隔5分钟读板一次，最长可监测60分钟；
6.在酶标仪上设置合适的校正波长；
7.EDK不同，以及说明书上所要求的读板时间不同均可能导致OD值的差异。
原创作者：上海沪鼎生物科技有限公司
