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细胞的活性与DNA合成
点击次数：377 发布时间：2016/7/20 8:41:37
细胞的活性与DNA合成
细胞的活性
流式细胞术常采用两类荧光探针判断细胞的死活，一类是能透过活的细胞膜进入细胞的分子，如FDA（FI-uorescein Diacetate，二醋酸酯荧光素）；另一类是不能透过活细胞膜进入细胞中，但能对固定的细胞、膜有缺损的细胞核进行染色的荧光探针，如PI或EB。所以可通过这两类荧光探针判断细胞的死活。
FDA是不带电荷的酯溶性分子，所以很容易透过细胞膜。FDA本身不发荧光，但进入细胞后，被细胞内非特异性酯酶水解后，释放出能发黄绿色荧光的荧光素分子，如果细胞膜是完整的，这些荧光素分子被活细胞所俘获，发出黄绿色荧光；如果细胞有损伤，荧光素分子将从细胞内流失掉，不发荧光。检测方法为：先配制溶于丙酮0.5%的FDA贮液，由于这种贮液极易挥发，应迅速配成1:1000的FDA工作液（在PBS中），检查细胞活性时以10ul FDA工作溶液加至100ul细胞悬液中，细胞悬液浓度为1×105细胞/ml—1×107细胞/ml，以蓝光激发，观察细胞是否发射黄绿色荧光。
PI或EB检查法：将PI或EB在PBS中制备成50ug/ml的贮液，使用时加至细胞悬液中，细胞浓度约为106细胞/ml染料终浓度为1—5ug/ml，5分钟后可观察。
DNA合成
为了准确地测定一个细胞群体的动力学，不仅需要了解细胞的DNA含量，而且应了解DNA的合成率。流式细胞术采用BrdU（Bromodeoxyuridine，溴脱氧尿嘧啶核苷）是胸苷的一种类似物，如果以BrdU处理细胞，BrdU将代替胸苷参与DNA合成。再用FITC或者其它荧光探针标记的BrdU单克隆抗体与已掺入BrdU的细胞孵育，那么FITC的黄绿色免疫荧光的强度就代表细胞内DNA合成的情况。
用双参数流式细胞光度术可以同时测定细胞内总DNA含量和DNA合成。一个参数用PI标记DNA，发红色荧光；另一个参数用FITC标记的BrdU单克隆抗体探测细胞内DNA合成，发黄绿色荧光，其简要的染色制备步骤为：
1、Brdu掺入细胞
2、固定细胞
3、RNA酶消化
4、提取组蛋白
5、一抗孵育
6、二抗孵育
7、PI染色
8、流式细胞术分
