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散射光的测量
点击次数：512 发布时间：2016/7/14 8:37:23
散射光的测量
在流式细胞术中，从光的散射信号可以得到非常有价值的信息。因为细胞对光的散射是细胞在未遭受任何破坏情况下固有的特性，所以可以用散射光的信号对未染色的活细胞进行分析和分选。
细胞在液流中通过测量区时，经激光照射，细胞向空间360度立体角的所有方向散射光线，散射的信号与细胞的大小形状，质膜和细胞内部的折射率有关。经过固定和染色的细胞，因折射率有了变化，故其散射状况与未固定或未染色的不同。散射光与细胞参量间的关系与散射角、照明光束的形状、收集散射光立体角的大小等都有关。在流式细胞术中常被利用的有前向角散射和侧向散射，前者亦称0.散射，后者亦称90度散射。
前向角散射
前向角散射亦称小角散射或0度散射，例如X轴是液流方向，Z轴表明入射的激光束方向，入射光与液柱在0点相交，0点是测量区。如果在与XY面平行的XY面上放一个半径为R的透视镜，透视中心部分半径为Rmin的圆是不透光的，则只有立体角范围内的散射光减去落到Rmin圆面积上的散射光才被透视镜收集、检测。Rmin圆内的散射光是被阻挡的部分，以防止入射光直接进入从而掩盖了散射光。在实际仪器中，这部分所占立体角大约在2度上下。
用核质比为0.72，球形活细胞所测得的前向角散射光与细胞外径平方的关系曲线，实线对应收集散射光的立体角是1.7度—20.3度，虚线对应的立体角1.7度—10度，二者差异不大，且大体上为一直线。
同样类型的细胞，如果核质比不同，其散射光强度也略有差异。固定了的细胞，因其质膜被破坏的情况不一样，相应的散射光与直径间的关系要复杂一些，特别是与核质比的关系更为复杂。一般我们仅能说前向角散射光的强度与细胞的大小有关。对同一个细胞群体，散射光强的，其细胞大一些；而散射光弱的，其细胞小一些。究竟更准确的关系是什么，因细胞不同、处理方法不同、固定方法不同，以致我们无法讲出更精确的结论。甚至当细胞是非球形的如禽类的红细胞、扁平状的精子时，由于细胞在液流中空间取向的不同，也可导致对同种细胞测得的前向角散射光信号完全不同，这是必须注意的。
侧向散射
侧向散射亦称90度散射或大角散射，会聚透镜放在与XZ面平行的XZ平面内，因而收集到的是细胞通过测量区时侧方向的散射光。侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感。除了侧向散射光外，还有北向散射，亦称180度散射，但很少使用。
以上所有的散射光波长与人射光一致。这是散射光与荧光的最大不同之点，在使用中务须牢记。散射光的探测器可以是硅光电管，也可以是光电倍增管，前者多用于探测前向角散射光，后者用于探测侧向散射光。
在实际使用中，仪器首先是对光散射信号进行测量。因为通过测量区饿每个细胞不管它是否已被染色都能散射光线所以光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色的细胞和未染色的细胞。光散射测量最有效的用途，是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。用前向角散射和侧向散射双参数测定，可从不加任何染料的小鼠全骨髓中鉴别出若干个亚群。
除散射光外，流式细胞计常测量的另一个非荧光信号是Coulter体积，其原理在后面介绍。
