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NAD-苹果酸酶试剂盒说明书
点击次数：239 发布时间：2016/9/12 8:38:15
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王**
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NAD-苹果酸酶（Malic enzyme，NAD-ME）试剂盒说明书
分光光度法 50 管/48 样
测定意义：
ME 广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和 CO2，以及伴随 NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME 活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物 ME 活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将 ME 分为
NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.1.40)。
测定原理：
NAD-ME 催化 NAD+还原成 NADH，在 340nm 下测定 NADH 增加速率。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：60mL×1 瓶，4℃保存。；试剂一：液体 40mL×1 瓶，4℃保存；试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 支，4℃保存；用时加 2mL 蒸馏水充分溶解备用；试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存；用时加 1mL 蒸馏水充分溶解备用。
样本的前处理：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：
提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细
菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，
取上清，置冰上待测。
提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细
菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，
取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、将试剂一、二、三和四置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上。如果一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三和四按下表比例配成混合液后置于 37℃ （哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上。
3、操作表：
| 试剂名称（μL） | 测定管 |
| | |
| 试剂一 | 600 |
| | |
| 试剂二 | 225 |
| | |
| 试剂三 | 30 |
| | |
| 试剂四 | 15 |
| | |
| 样本 | 30 |
将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，混匀，立即记录 340 nm 波长下初始吸光度 A1
和反应 1min 后的吸光度 A2，计算ΔA=A2-A1。
注意：如果ΔA＜0.01，可将反应时间延长到 2 分钟或 5 分钟。
NAD-ME 活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（U/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T= 4823×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（U/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T = 4823×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（U/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T =9.646×ΔA V 反总：反应体
系总体积，9×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比
系总体积，9×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比
色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，
1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，
500 万。
原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司
