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实体瘤细胞脱核制备
点击次数：208 发布时间：2016/7/25 8:22:20
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实体瘤细胞脱核制备
细胞核悬液是流式细胞术的一个重要实验对象，在只进行细胞核内化学成分分析，特别是作DNA分析时，十分有用。从组织分离细胞核的标准生化程序通常需要匀浆和离心等步骤，这些程序有时导致组织分离不完全，细胞核受到损伤而使DNA释放，或者造成核团块，所以不能用于流式细胞术分析。近年来发展的细胞脱核制备方法，可以来自实体组织，也可来自石蜡包埋的组织块。这一节主要介绍从实体组织制备细胞核。
一步快速核分离和染色程序
Thornthwaite的制备方法为：首先制备细胞核分离液：在0.01M磷酸等渗盐缓冲液中（146mM NaC1)(pH7.2),溶有Ca2+（1mM CaC12）、Mg2+（0.5mM MgSO4）、0.6%NP40（V/V）和0.2%牛血清白蛋白（BSA）。BSA并不是绝对需要的，有稳定细胞核膜的作用。将这种细胞核分离液在冰箱中保存，分离核的能力可保持3个月。DNA荧光染料DAPI以10ug/ml的浓度溶于细胞核分离液中，合并成为核分离和染色液。核分离和染色程序如下：
用剪刀将0.1—0.3g组织剪碎，放入核分离液和DAPI染液中，1ml核分离液约能分离0.1g组织，室温下保持3分钟后，用70um尼龙网过滤，以移去组织碎片。将过滤后的悬液用26号注射器抽吸两次，使单个核分离开。根据细胞大小再选择适当孔径的尼龙网过滤，然后用荧光显微镜镜检，如果仍存在多于2%的细胞核聚在一起，应再用26号注射器抽吸以确保是单个细胞核的悬液。如不立刻进行分析，样品在4℃可保持48小时。分析前，需要再进行注射器抽吸和过滤。
这种方法综合了核分离和DNA荧光染色，比较简单易行，广泛应用于各种正常实体组织和肿瘤组织。
Darzynkiewicz等人采用另一细胞核分离液，效果也很好。分离液的成分为：0.1%（V/V）Triton X—100溶于0.08NHCI和0.146MNaCI中，加入0.08NHCI（pH1.6）是为了把大多数组蛋白从核中提取出，使DNA更接近被嵌入的荧光染料。染色和核分离程序同上述Thornthwaite的方法，只改变其中细胞核分离液。
Taylor等人的快速一步染色方法为：用剪刀将实体瘤组织剪成1—5mm3的碎块，将其悬浮到2—5ml含有5% Triton X-100和DNA荧光染料的完全培养介质中，轻轻振荡，使细胞丛结完全分散，以50um尼龙网过滤，所有染色过程都在冰上进行，5分钟内即可上机分析。DNA染料使用的终浓度，PI和EB为50ug/ml，RNA酶以1mg/ml的终浓度直接加入染液中。MI为100ug/ml，DAPI和HO 33342为1ug/ml，为了获得高质量的DNA直方图，应注意所用荧光染料与DNA的比例。实验表明，2ml荧光染液中有1—3×106个细胞是适宜的。
上述一步快速核分离和染色程序都使用了非离子去污剂NP40或Triton X-100处理细胞，获得核悬液。这种方法制备速度块，仅用几分钟，DNA直方图的质量好，CV值仅为2—3%，可广泛用于实验室和临床工作中。
原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司
