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血清白蛋白的分离纯化
点击次数：1400 发布时间：2016/7/11 9:13:39
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血清白蛋白的分离纯化
目的要求
通过血清白蛋白的分离和纯化，了解离子交换层析法的原理
实验原理
离子交换层析法常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素，阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素。
蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基因或碱性基团结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH有关，因为决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷界团之间的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变pH或离子强度来实现。与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。本实验利用盐析、离子交换层析来分离、纯化血清白蛋白。首先用盐析作初步分离，在半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白沉淀下来，经离心后上清中含白蛋白。第二步用凝胶层析法脱盐，蛋白质的相对分子质量较硫酸铵大的多，选择适意的凝胶分级范围，依分子筛效应，除去粗分离样品中盐类。最后经离子交换层析纯化目标蛋白，利用蛋白质的pl，选择合适的pH缓冲溶液，改变溶液的离子强度，以使目标蛋白杂质白分开，经脱盐的样品溶解在0.025mol/L醋酸缓冲溶液中，加到二乙基氨基乙基纤维素层析柱上。在此pH时，DEAE纤维素带有正电荷，能吸附带负电荷的白蛋白。而y-球蛋白带正电荷，不被吸附故直接流出，此时收集所得即为提纯的y-球蛋白。提高盐浓度，离子交换柱上的B-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。继而将盐浓度提高至0.3mol/L醋酸铵，则白蛋白被洗脱下来，此时收集的即为较纯的白蛋白。
试剂和器材
1、试剂
（2）、0.3mol/L、NH4Ac缓冲液（pH6.5）。称取NH4Ac23.13g，加蒸馏水800mL溶解，用稀氨水或稀HAc，准确调pH6.5，再加蒸馏水至1000mL。
（2）、0.06mol/L NH4Ac缓冲液（pH6.5）。取0.3mol/L NH4Ac用蒸馏水作5被稀释。
（3）、0.02mol/L NH4Ac 缓冲液（pH6.5）。取0.06mol/L NH4Ac用蒸馏水作3倍稀释。
以上三种缓冲液必须准备配制，用蒸馏水稀释后应再用pH计测试pH。由于NH4Ac是挥发性盐类，故溶液配置后，必须密闭保存，以防pH和浓度发生改变，否则将影响所分离蛋白质的纯度。
（4）、1.5mol/L，NaCI-0.3mol/L，NH4Ac。称取NaCI 87.7g溶于0.3mol/L，NH4Ac（pH6.5）中至1000mL。
（5）、饱和硫酸铵溶液。称（NH4）2SO4，850g加入1000mL蒸馏水中，在70～80℃水浴中搅拌促溶，室温下放置过夜，瓶低析出白色结晶，上清即为饱和硫酸铵溶液。
（6）、200g/L磺基水杨酸。
（7）、10g/L，BaCI2
2、材料
血清（人和其他动物）
3、器材
层析柱（1cm×15cm、1cm×25cm），固定架，凹孔反应板，滴管，水浴锅。
操作方法
1、层析柱的准备
（1）、葡聚糖凝胶G-25层析柱
a.凝胶的准备：称取葡聚糖凝胶G-25干胶（100mL 凝胶柱床需干胶25g），按每克干胶加入蒸馏水约50mL，轻轻摇匀，置于沸水浴中1h，并经常摇动使气泡逸出，取出冷却。凝胶沉淀后，倾去上清液，加入2倍体积的0.02mol/L，NH4Ac缓冲液（pH6.5），混匀。静置片刻待凝胶颗粒沉降后，倾去上清液。再用0.02mol/L，NH4Ac缓冲液（pH6.5）重复处理一次。
b.装住：将层析柱垂直固定于架上，管内加入少量0.02mol/L，NH4Ac缓冲液，再将上述经过处理的凝胶悬浮连续注入层析管中，直至所需凝胶床高度（20cm）。装柱时应注意凝胶粒均匀，床面应平整，凝胶柱床内不得有界面、气泡。装住后，层析柱接上恒压贮液瓶，调节流速2mL/min，用0.02mol/L，NH4Ac缓冲液（pH6.5）洗涤平衡。
c.再生和保存：此凝胶层析柱可反复使用。每次用完后以所需的缓冲液洗涤平衡后即可再用。
为防止凝胶霉变，暂不用时应当用含0.2g/L，NaN3缓冲液洗涤后放置，久不用时宜将凝胶粒由柱内倒出，加0.2g/L，NaN3湿保存于4℃冰箱。
（2）、DEAE-纤维素层析柱
a.酸碱处理：称取DEAE-纤维素干粉，按干重1:10～15，先用0.5mol/L，NaOH浸泡30min、水洗至pH7.0，改用0.5mol/L,HCI浸泡30min、水洗至pH4.0，再用0.5mol/L NaOH浸泡30min后水洗至pH7.0
b.装住、平衡：将经过酸碱处理的DEAE-纤维素用0.02mol/L，NH4Ac缓冲液浸泡用稀醋酸将悬浮液的pH调至6.5静置，让树脂下沉，去上清。按此法用0.02mol/L，NH4Ac缓冲液洗涤三次，每次洗涤后重较pH，直至pH为6.5并保持不变
c.再生和保存：此凝胶层析柱可反复使用。每次用完后可用1.5mol/L，NaCI-0.3mol/L,NH4AC缓冲液流洗，再用0.02mol/L，NH4Ac缓冲液（pH6.5）洗涤平衡后即可重复使用。多次使用后，如杂质较多或流速过慢，可将纤维素倒出，先用1.5～2mol/L，NaCI浸泡，水洗，再如上述用酸碱处理后重新装柱。如暂不使用，应以湿态保存在含1%正丁醇的缓冲液中，以防霉变。
2、分离纯化
（1）、盐析
取0.5mL血清，边摇边缓缓滴入0.5mL饱和硫酸铵，混匀后室温下静置10min，然后离心3000r/min，10min，用滴管小心吸出上层清液，作为纯化白蛋白之用。
（2）、脱盐
a.上样：小心控制使经0.02mol/L，NH4Ac缓冲液（pH6.5）洗涤平衡后层析柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床表面。立即用细长滴管将盐析所得的粗制蛋白质溶液小心而缓慢地加到柱床表面，使样品液面降至床表面为止。用2mL、0.02mol/L，NH4Ac缓冲液洗涤层析柱壁，将其放入凝胶床后，重复洗涤三次，接上恒压贮液瓶。
b.收集：继续用0.02mol/L，NH4Ac缓冲液流洗，在反应板凹孔接触到磺基水杨酸溶液，随时检查流出液中是否含有蛋白质，若流出液滴入凹孔接触到磺基水杨酸溶液时，出现白色浑浊或沉淀，表示已有蛋白质流出。立即收集流出蛋白质液体，白蛋白脱盐时可连续收集3～4管，每管收集约1mL，收集的各管中取2滴流出液于反应板各孔内，加1滴10g/L，BaCI2检查有无,将无的各管合并，有的弃去
c.平衡：收取蛋白质后的凝胶层析柱继续用0.02mol/L，NH4Ac缓冲液流洗，用10g/L,BaCI2检查流出液，当检查为阴性后，继续洗涤1～2个柱床体积。凝胶层析柱即已再生平衡，可再次使用。
（3）、纯化
脱盐后白蛋白样品上柱后，改用0.06mol/L，NH4Ac缓冲液（pH6.5）洗涤，流出约30mL后，将柱上的缓冲液面降至与纤维素床面平齐。然后改用0.3mol/L,NH4Ac缓冲液（pH6.5）洗脱，并用20%磺基水杨酸检查流出液是否含有蛋白质。当有蛋白流出时，立即连续收集3管，每管10滴，此即为纯化的白蛋白液，取其中蛋白质浓度高的两管留作含量测定和纯度鉴定。
注意事项
（1）、准确配制NH4Ac缓冲液并严格调整其pH至6.5.
（2）、保持层析柱床面完整，上述或加缓冲液时，切勿将柱床表面冲起。
（3）、流洗时注意收集样品，切勿使样品跑掉，并注意层析柱不要流干，进入气泡。
原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司
