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蛋白质的表达、分离、纯化
点击次数：288 发布时间：2016/7/7 8:52:01
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蛋白质的表达、分离、纯化
目的要求
1、了解克隆基因表达的方法和意义
2、了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法
实验原理
克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机制，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价藕连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙稀酰胺凝胶电泳进行分析。
试剂和器材
1、试剂
LB液体培养基：Trytone 10g，酵母提取物5g，NaCI 10g，用蒸馏水配至1000mL。
氨苄青霉素：100mg/mL。
上样缓冲液：100mmol/L，NaH2PO4，10mmol/L，Tris，8mol/L尿素，10mmol/L，2-ME，pH8.0.
清洗缓冲液：100mmol/L，NaH2PO4，10mmol/L，Tris，8mol/L尿素，pH6.3.
洗脱液缓冲液：100mmol/L，NaH2PO4,10mmol/L，Tris，8mol/L尿素，500mmol/L咪唑，pH8.0.
IPTG：终浓度为1mmol/L。
2、器材
摇床，离心机，层析柱（1cm×10cm）。
操作方法
1、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导
（1）、接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL，LB液体培养基中（含100ug/mL氨苄青霉素），37℃振荡培养过夜。
（2）、将1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL，氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.6～0.8.取10uL样品用于SDS-PAGE分析。
（3）、加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，37℃继续培养1～3h。
（4）、12000r/min离心10min，弃上清，菌体沉淀保存于—20℃或—70℃冰箱中。
2、氯霉素酰基转移酶重组蛋白质的分离、纯化
（1）、NTA层析柱的准备。在层析柱中加入1mL，NTA介质，并分别用8mL，去离子水，8mL上样缓冲液洗涤。
（2）、重组蛋白的变性裂解。在水浴中冻融菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液，用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60min，4℃12000r/min离心30min，将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10uL上清样品用于SDS-PAGE分析。
（3）、上清样品以10～15mL/h流速上Ni2+,-NTA柱，收集流出液，取10uL样品用于SDS-PAGE分析。
（4）、洗脱杂蛋白。用清洗缓冲液以10～15mL/h流速洗柱，直至OD280=0.01，分步收集洗脱液，约3～4h，取10uL洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE分析。
（5）、洗脱目标蛋白。用洗脱液缓冲液洗柱，收集每1mL级分，分别取10uL样品用于SDS-PAGE分析。
原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司
