酵母中的基因组编辑

设计微生物用于原材料的工业化生产涉及：设计、构建、测试和学习周期的反复进行。目前，构建阶段（菌株设计）是最占用时间的。迫切需要并行进行这些工程步骤，以加快这一过程。设计的核酸酶可以促进多重整合，RNA引导的CRISPR-Cas系统大大简化了位点特定性限制性内切酶的生产。与异二聚体的TALEN和锌指核酸酶相反，在CRISPR-Cas系统的靶向特异性，是由易于编程的RNA组件所赋予，可通过表达与基因组靶位点互补的短RNA（gRNA）而重定向。

因此，现在利用CRISPR-Cas系统对高等动物进行多重设计的报道有很多。大多数研究使用该系统来诱导断裂，可被非同源末端连接修复，从而导致可变长度的缺失和基因功能的丧失。关于整合功能性遗传结构或将变化精确地引入遗传位点，还很少见报道，部分是由于这些类型细胞中的同源重组率低。相比之下，啤酒酵母（S. cerevisiae）细胞有利于同源重组，从而提出了“将CRISPR-Cas系统应用于更复杂的工程任务”的可能性。

有研究小组在酿酒酵母中，将CRISPR-Cas系统引入一个单点突变或小构造，以破坏三个基因，并将基因变体库整合在一个单一位点。该技术也适用于裂殖酵母，但据我们所知，还没有应用到其他工业相关酵母的报道，例如克鲁氏乳酸酵母等。目前报道的程序具有很高的效率，但是要求选择所有的CRISPR-Cas元件，这通过为每个靶向位点新组合克隆一个复杂的表达质粒而得以实现。这一要求限制了这些方法的灵活性。

在这项研究中，研究人员使用一种模块化的gRNA传递策略，来实现点突变的多元整合，包括在三个位点同时引入五个精确修改，以赋予菌株增强的耐醇性。

研究人员表明，一个单一线性化质粒（携带多重PCR生产的引导RNA和供体DNA盒）的共转化，可促进点突变和大片段缺失构建的高效集成。这种技术可让研究人员以64%的效率，恢复无标记的三重工程事件，而不需要选择所有gRNA的表达。gRNA盒可以通过PCR很容易地产生，并在任何组合中传递。

研究人员用这种方法快速制备了五个特定的等位基因组合，并确定了协同效应。为了制备粘康酸的生产途径，研究人员将6个DN段（共24kb）整合入原始态酿酒酵母中的三个位点中（在一次单一转化中）。利用微小的改装，研究人员在乳酸克鲁维酵母中集成了一个类似的途径。组合的gRNA传递所提供的灵活性，大大加速了用于基础研究和工业发酵的复杂菌株的设计。