sp法步骤分析

SP法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法.

按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。

一般的sp法步骤啊,具体如下：

1.烤片，68℃，20分钟,

2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min －－二甲苯II 20 min－－100%酒精I 10min －－100%II 10min －－95% 5min－－ 80% 5min－－ 70% 5min

3.阻断 灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；

4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。

5. 正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗.

6. 滴加一抗4℃ 冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；

滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;

7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;

8. DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，

苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。