劲马解析关于WB实验的十五个常见问题

上海劲马生物总结：WB是Western blotting的简写，一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质（或酶）。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western（西）印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决定簇结合，然后用另一种蛋自质，如135I-蛋白A或辣根过氧化物酶连接的山羊抗IgG检测已结合上去的抗体。本法所需时间6小时或过夜。而我们客户在做WB实验时经常为以下问题犯难？它们是什么呢？一起跟随小编一起来看上海劲马生物最新总结的Western blotting十五个常见问题的解析：
1. 细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？
解答：一般5×10^6就足够了
2. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好
NaF去抑制磷酸化酶的活性。
3. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？
解答：260kd的蛋白不好做， 分离胶用6％， Stacking Gel 3.5％。还可选
用金斯瑞的预制胶
4. 蛋白变性后可以存放多久？
解答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要
细菌消化掉（也是被酶水解了）。
5. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？
解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。
6. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？
解答：疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）
7. Western Blot 中抗体的重复应用问题
解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反
使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
8. NC膜\ PVDF膜\ 尼龙膜怎样鉴别？
解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。
就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。
就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。
就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。
就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。
9. 在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
10.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？
解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。
11.不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？
解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）（优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。
12.Western Blot哪种染色好？
解答：（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用于正电荷的膜。灵敏度低。
（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。
（3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。
13.转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据0.8mA/cm2，一般1小时左右？
解答：不是的， 半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。
14.加甲醇的目的是什么？
解答：加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去.（特别是在硝酸纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱）。
15.请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？
解答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。
上海劲马WB实验服务流程
1.客户提供一抗，最好是进口的抗体，本公司可代购
2.提取样本总蛋白，进行总蛋白定量
3.根据总蛋白定量的结果，微调各个样本间浓度差异，高温变性，加入loading buffer，上样跑胶，以及转膜显色等步骤
4.利用软件对所得胶片进行扫描，用相对定量方法进行定量分析时，要对管家蛋白等参比蛋白进行同样操作，用所得到的值进行蛋白量的校正，最后求得目的蛋白的相对表达量
5.提供实验报告：包括详细的实验方法及western blot结果的相关图表

原创作者：上海劲马实验设备有限公司