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问充质干细胞向脂肪细胞系分化
点击次数：164 发布时间：2016/1/15 14:44:15
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黄*
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问充质干细胞向脂肪细胞系分化
1．材料
(1)MSC培养液DMEM(低糖)加15％FBS。
(2)诱导分化培养液[)MEM(高糖)培养液中加入lμmol／L地塞米松、O．2mmol／L吲哚甲基素、0．Oμg／ml胰岛素、0．5mmol／L 3一异丁基一l一甲基黄嘌呤、10％F13S，50U／ml青霉素、50μg／ml链霉素，滤过除菌。
(3)维持脂肪细胞生长的培养液DMEM(高糖)培养液中加入O．Olmg／ml胰岛素、lO％FBS、0．05U／ml青霉素、0．05μg／ml链霉素。
(4)试剂1mmol／L地塞米松，用无水乙醇配制；吲哚甲基素，用二甲基亚砜(DM—SO)配制；O．1mg／ml胰岛素，用双蒸水或生理盐水配制；500mmol／L 3一异丁基一1一甲基黄嘌呤，用DMSO配制。
(5)器具各种吸管、6孔培养板、10％甲醛液、吖啶橙(acridine orange，AO)染液，O．5％油红O(oil red O)染液。
2．方法
(1)取2×105个细胞培养在6孔培养板上，每孔加2mlMSC培养液，置于37℃，5％CO2孵箱中培养，每2～3d换液1次，直至细胞完全融合(7～12d)。
(2)待MSC 100％汇合后(完全汇合利于诱导)，加诱导分化培养液，于37℃、5％CO2孵箱中诱导培养3d，然后换维持脂肪细胞生长培养液继续培养1～3d，再换诱导分化培养液，如此反复涛导3次。
(3)诱导3个循环后，换维持脂肪细胞生长的培养液继续培养7d，每2～3d换1次培养液。在诱导分化培养时，以不加诱导剂培养的MSC作为阴性对照，只加维持生长培养液，与诱导分化组相同步骤共同处理。
3．结果观察可在显微镜下观察到诱导分化的脂肪细胞有脂肪滴存在。为进一步验证脂肪细胞的分化，可将细胞用PBS洗2次，用lO％甲醛液固定，再用AO、油红O染液染色，以不加诱导剂培养的MSC细胞作为对照，诱导分化的脂肪细胞也可测定甘油一3一磷酸脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogerlase，GPDH)的活性。
1．材料
(1)MSC培养液DMEM(低糖)加15％FBS。
(2)诱导分化培养液[)MEM(高糖)培养液中加入lμmol／L地塞米松、O．2mmol／L吲哚甲基素、0．Oμg／ml胰岛素、0．5mmol／L 3一异丁基一l一甲基黄嘌呤、10％F13S，50U／ml青霉素、50μg／ml链霉素，滤过除菌。
(3)维持脂肪细胞生长的培养液DMEM(高糖)培养液中加入O．Olmg／ml胰岛素、lO％FBS、0．05U／ml青霉素、0．05μg／ml链霉素。
(4)试剂1mmol／L地塞米松，用无水乙醇配制；吲哚甲基素，用二甲基亚砜(DM—SO)配制；O．1mg／ml胰岛素，用双蒸水或生理盐水配制；500mmol／L 3一异丁基一1一甲基黄嘌呤，用DMSO配制。
(5)器具各种吸管、6孔培养板、10％甲醛液、吖啶橙(acridine orange，AO)染液，O．5％油红O(oil red O)染液。
2．方法
(1)取2×105个细胞培养在6孔培养板上，每孔加2mlMSC培养液，置于37℃，5％CO2孵箱中培养，每2～3d换液1次，直至细胞完全融合(7～12d)。
(2)待MSC 100％汇合后(完全汇合利于诱导)，加诱导分化培养液，于37℃、5％CO2孵箱中诱导培养3d，然后换维持脂肪细胞生长培养液继续培养1～3d，再换诱导分化培养液，如此反复涛导3次。
(3)诱导3个循环后，换维持脂肪细胞生长的培养液继续培养7d，每2～3d换1次培养液。在诱导分化培养时，以不加诱导剂培养的MSC作为阴性对照，只加维持生长培养液，与诱导分化组相同步骤共同处理。
3．结果观察可在显微镜下观察到诱导分化的脂肪细胞有脂肪滴存在。为进一步验证脂肪细胞的分化，可将细胞用PBS洗2次，用lO％甲醛液固定，再用AO、油红O染液染色，以不加诱导剂培养的MSC细胞作为对照，诱导分化的脂肪细胞也可测定甘油一3一磷酸脱氢酶(glycerol-3-phosphate dehydrogerlase，GPDH)的活性。
原创作者：上海研生实业有限公司
