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DNA重排技术
点击次数：3402 发布时间：2016/1/8 14:57:43
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DNA重排技术由于可以产生丰富的重组突变体文库，自出现以来．就受到了人们的极大关注，尤其是产业界对其表现出浓厚的兴趣。目前，该技术已经在许多领域得到广泛的应用．已报道的有：在非天然环境下的生物分子活性和稳定性的改善、抑制剂或抗生素抗性和新功能的开发、底物范围及底物特异性的改变、新型疫苗和药物分子的发现、抗体亲和力的提高、新的代谢途径的开发等。
从操作的对象来看，DNA重排主要可分为单一基因重排、家族基因重排、生物代谢途径基因重排等。
(1)单一基因重排 目前，利用DNA重排技术已经成功对许多单一基因如工业用酶、抗体以及一些蛋白质等进行了定向改造，使酶活性、底物特异性以及抗体亲和性、蛋白质的功能、稳定性等得到了明显提高。由于它构建的是重组库，其效率一般要显著高于构建随机库的易错PCR。与定点突变相比，DNA重排不依赖于目前尚难以得到的特定蛋白质的结构与功能关系信息。
绿色荧光蛋白(GFP)是一种被广泛用来作为标记的蛋白质。为了增加它的荧光性，采用DNA重排技术对GFP译基因进行3个循环的筛选，每次循环筛选10000个克隆子，得到最好突变子的荧光信号比天然GFP提高了45倍。序列分析表明，在这个突变子中有三个疏水性氨基酸被亲水氨基酸残基所取代。另外，在大肠杆菌中超量表达时，大多数野生型GFP形成包涵体，只有少量可溶的GFP具有荧光性。而经DNA重排后的更多的GFP保持了可溶性和荧光性，其原因在于三个位置上的突变使GFP避免聚集并保持蛋白质的可溶性和正确的折叠，而这种正确的折叠正是荧光发色基团的自催化激活所必需的。这个例子表明，通过DNA重排，在优化某一特定功能时，蛋白质的多种其他特性如密码子的使用、蛋白质的折叠、蛋白酶的敏感性以及基因表达强度等可同时得到优化，这是基于定点突变的理性设计无法一次完成的。
(2)家族基因重排 当用DNA重排技术对单一基因进行改造时，多样性来源于PCR过程中引入的随机点突变。由于绝大多数点突变都是有害的或中性的，因此随机突变频率必须非常低，目的功能的进化比较缓慢。但自然进化产生的同源序列由于有害突变在漫长的进化过程中已经被淘汰掉了，因此富含“功能性”的多样性。利用这些自然进化产生的家族同源基因序列作为起始模板，进行DNA重排，可以迅速地将来源于不同种属的DNA组合在一起，从中筛选得到不同序列的优势组合的可能性大大增加。
下面以头孢菌素酶基因为例来说明家族基因重排相对单基因重排更具优越性：首先从四种不同的细菌——Citrobacter、Kiebsiella、Enterobacer和Yersinia中分别获得长度为1．6kb的头孢菌素酶基因。它们的DNA同源性很低，从58％到82％不等。然后每个基因分别重排，从各自的文库中选出50000个克隆移人含羟羧氧酰胺头孢菌素的平板。从平板上筛选得到最好的突变子，它对羟羧氧酰胺头孢菌素的抗性相对于亲本来说大约增加了8倍。 抗体
作为比较，对四个基因进行家族基因重排来构造头孢菌素酶基因的重组文库。同样选出50000个克隆移人含羟羧氧酰胺头孢菌素的平板，从中筛选出最好的克隆，与抗性较强的亲本相比，其抗性增加了270倍(从O．38μg／mL到200μg／mL)；与抗性较弱的亲本相比，其抗性增加了540倍(从O．75μg／mL到200μg／mL)。由此可以看出，家族基因重排的效果要比单基因重排好得多。
对家族基因重排中得到的性状最优良的突变株进行进一步研究表明它含有来于4个不同亲本中3个亲本的8个片段，7个交叉的地方都发生在序列同源的区域，并且这个突变株含有高达33个的点突变。
由于上述4个基因是来源于不同种屑，因此与经典的杂交育种技术相比，DNA重排可以迅速地将来源不同种属的DNA组合在一起，打破了传统物种之间由于生殖隔离导致的界限。上述实验的成功同时也表明，利用不同种属之间的同源序列，通过家族DNA重排可以加速体外定向进化过程，这是体外分子进化的一大进步。
(3)生物代谢途径的改造长期以来，人类一直利用微生物生产许多小分子药物如抗生素、抗真菌剂、杀虫剂、抗肿瘤药物以及免疫抑制剂、心血管药物等。在许多情况下，编码相关生物合成酶的基因多是未知的，并且常常出现于一个操纵子中或以基因簇的形式出现。而且参与生物合成的酶又常常是一些多酶复合体系，因此利用常规蛋白质工程或体外定向进化技术，很难对这些生物合成途径进行理性化的改造以提高产量或产生新的同系物，因为除了蛋白质工程的难度外，测定途径的限速步骤是非常费力和不确定的。而DNA重排则非常适合于优化这样的途径，因为整个代谢途径能当作一个单元进行进化，而无需了解限速步骤以及对蛋白质的结构和功能方面更为详细的分析。利用DNA重排，通过多种突变，可以有效协调一个代谢途径中不同的相互作用，使总的代谢效果迅速进化，这是其他策略所无法完成的。抗体
以改造盐脱毒途径为例来说明DNA重排如何改造生物的代谢途径。首先从金黄色葡萄球菌的pI258质粒中得到一个长度为2．7kb的操纵子．它含3个与盐脱毒相关的基因，将其与pUCl9质粒相连接得到一个5．5kb的质粒pGJl03．并转人大肠杆菌培养。接着，为了进一步提高抗性，从培养物中提取质粒并用DNase I消化成较小的片段后，以无引物PCR法进行重聚。然后用BamH I消化PCR产物，纯化得到5．5kb的片段，电转化法转人大肠杆菌。将转化子在含不同浓度盐的固体培养基上培养，筛选出1500～4000个耐较高浓度盐的菌落，混合后培养并提取质粒，重复以上步骤。经过3轮的重排后，在逐渐增加盐浓度的生长条件下获得一个最好的突变株。该突变株的盐耐受能力提高达40倍之多，盐的还原速率也增加了12倍。它可以在盐浓度高达500mol／L(接近盐溶解度的极限)条件下生长。而且经过3轮的重排和筛选，操纵子被整合到染色体内，导致稳定的盐抗性表型的出现。而一个没有进行重排的控制质粒，同样经过3轮筛选，盐的抗性却没有任何提高，同时该质粒也没有整合到染色体内。对操纵子进行测序表明它包含13个碱基突变，导致位于细胞膜泵上的3个氨基酸发生突变。
从操作的对象来看，DNA重排主要可分为单一基因重排、家族基因重排、生物代谢途径基因重排等。
(1)单一基因重排 目前，利用DNA重排技术已经成功对许多单一基因如工业用酶、抗体以及一些蛋白质等进行了定向改造，使酶活性、底物特异性以及抗体亲和性、蛋白质的功能、稳定性等得到了明显提高。由于它构建的是重组库，其效率一般要显著高于构建随机库的易错PCR。与定点突变相比，DNA重排不依赖于目前尚难以得到的特定蛋白质的结构与功能关系信息。
绿色荧光蛋白(GFP)是一种被广泛用来作为标记的蛋白质。为了增加它的荧光性，采用DNA重排技术对GFP译基因进行3个循环的筛选，每次循环筛选10000个克隆子，得到最好突变子的荧光信号比天然GFP提高了45倍。序列分析表明，在这个突变子中有三个疏水性氨基酸被亲水氨基酸残基所取代。另外，在大肠杆菌中超量表达时，大多数野生型GFP形成包涵体，只有少量可溶的GFP具有荧光性。而经DNA重排后的更多的GFP保持了可溶性和荧光性，其原因在于三个位置上的突变使GFP避免聚集并保持蛋白质的可溶性和正确的折叠，而这种正确的折叠正是荧光发色基团的自催化激活所必需的。这个例子表明，通过DNA重排，在优化某一特定功能时，蛋白质的多种其他特性如密码子的使用、蛋白质的折叠、蛋白酶的敏感性以及基因表达强度等可同时得到优化，这是基于定点突变的理性设计无法一次完成的。
(2)家族基因重排 当用DNA重排技术对单一基因进行改造时，多样性来源于PCR过程中引入的随机点突变。由于绝大多数点突变都是有害的或中性的，因此随机突变频率必须非常低，目的功能的进化比较缓慢。但自然进化产生的同源序列由于有害突变在漫长的进化过程中已经被淘汰掉了，因此富含“功能性”的多样性。利用这些自然进化产生的家族同源基因序列作为起始模板，进行DNA重排，可以迅速地将来源于不同种属的DNA组合在一起，从中筛选得到不同序列的优势组合的可能性大大增加。
下面以头孢菌素酶基因为例来说明家族基因重排相对单基因重排更具优越性：首先从四种不同的细菌——Citrobacter、Kiebsiella、Enterobacer和Yersinia中分别获得长度为1．6kb的头孢菌素酶基因。它们的DNA同源性很低，从58％到82％不等。然后每个基因分别重排，从各自的文库中选出50000个克隆移人含羟羧氧酰胺头孢菌素的平板。从平板上筛选得到最好的突变子，它对羟羧氧酰胺头孢菌素的抗性相对于亲本来说大约增加了8倍。 抗体
作为比较，对四个基因进行家族基因重排来构造头孢菌素酶基因的重组文库。同样选出50000个克隆移人含羟羧氧酰胺头孢菌素的平板，从中筛选出最好的克隆，与抗性较强的亲本相比，其抗性增加了270倍(从O．38μg／mL到200μg／mL)；与抗性较弱的亲本相比，其抗性增加了540倍(从O．75μg／mL到200μg／mL)。由此可以看出，家族基因重排的效果要比单基因重排好得多。
对家族基因重排中得到的性状最优良的突变株进行进一步研究表明它含有来于4个不同亲本中3个亲本的8个片段，7个交叉的地方都发生在序列同源的区域，并且这个突变株含有高达33个的点突变。
由于上述4个基因是来源于不同种屑，因此与经典的杂交育种技术相比，DNA重排可以迅速地将来源不同种属的DNA组合在一起，打破了传统物种之间由于生殖隔离导致的界限。上述实验的成功同时也表明，利用不同种属之间的同源序列，通过家族DNA重排可以加速体外定向进化过程，这是体外分子进化的一大进步。
(3)生物代谢途径的改造长期以来，人类一直利用微生物生产许多小分子药物如抗生素、抗真菌剂、杀虫剂、抗肿瘤药物以及免疫抑制剂、心血管药物等。在许多情况下，编码相关生物合成酶的基因多是未知的，并且常常出现于一个操纵子中或以基因簇的形式出现。而且参与生物合成的酶又常常是一些多酶复合体系，因此利用常规蛋白质工程或体外定向进化技术，很难对这些生物合成途径进行理性化的改造以提高产量或产生新的同系物，因为除了蛋白质工程的难度外，测定途径的限速步骤是非常费力和不确定的。而DNA重排则非常适合于优化这样的途径，因为整个代谢途径能当作一个单元进行进化，而无需了解限速步骤以及对蛋白质的结构和功能方面更为详细的分析。利用DNA重排，通过多种突变，可以有效协调一个代谢途径中不同的相互作用，使总的代谢效果迅速进化，这是其他策略所无法完成的。抗体
以改造盐脱毒途径为例来说明DNA重排如何改造生物的代谢途径。首先从金黄色葡萄球菌的pI258质粒中得到一个长度为2．7kb的操纵子．它含3个与盐脱毒相关的基因，将其与pUCl9质粒相连接得到一个5．5kb的质粒pGJl03．并转人大肠杆菌培养。接着，为了进一步提高抗性，从培养物中提取质粒并用DNase I消化成较小的片段后，以无引物PCR法进行重聚。然后用BamH I消化PCR产物，纯化得到5．5kb的片段，电转化法转人大肠杆菌。将转化子在含不同浓度盐的固体培养基上培养，筛选出1500～4000个耐较高浓度盐的菌落，混合后培养并提取质粒，重复以上步骤。经过3轮的重排后，在逐渐增加盐浓度的生长条件下获得一个最好的突变株。该突变株的盐耐受能力提高达40倍之多，盐的还原速率也增加了12倍。它可以在盐浓度高达500mol／L(接近盐溶解度的极限)条件下生长。而且经过3轮的重排和筛选，操纵子被整合到染色体内，导致稳定的盐抗性表型的出现。而一个没有进行重排的控制质粒，同样经过3轮筛选，盐的抗性却没有任何提高，同时该质粒也没有整合到染色体内。对操纵子进行测序表明它包含13个碱基突变，导致位于细胞膜泵上的3个氨基酸发生突变。
原创作者：上海研生实业有限公司
